生物信息学文献翻译

翻译部分（生物信息学论文5-6页）translated by:何茂章

这个队列在补充图形1中，补充材料是在线的。MADS+K核苷酸矩阵在简约性何贝叶斯定理的标准下做进化分析。

简约性分析用PAUP*4.0执行。最大简约法树状结构是由把差异当做缺失数据的启发式搜索生成的。支持节点的辅助程序估计有1000个启发式搜索复制用初始的相同设置的方法。对于每一个复制辅助程序只有一个随机阶梯式附加。贝叶斯分析是用大都市耦合马尔卡夫链蒙特卡罗法执行的，就像在MrBayes V.3.1.1中一样。马尔卡夫链是经过5百万世代的竞选而没有被分子钟强行执行。4个随机重新整理的自定义开始的树状结构已经实施了。这个树状结构和最简约的树状图相符合。马尔卡夫链是从后验分布的树状结构中抽取的总共5000个树状结构中抽取每100个世代用于去计算分化枝的后验概率。最开始的12500个树状结构图被当做“burn-in”丢弃了。依照伽马分布交叉位点的特定比率的可逆模型的一般时间被用于缺省值的先前设定。对于正在跑的链，用一条链在0.2的缺省值设定下加热。

西红柿MIKC cＭＡＤＳ－Ｂｏｘ基因的表达

为了定义３６个西红柿MIKC c ＭＡＤＳ－Ｂｏｘ基因的ｍＲＮＡ表达的一般模式，做了特定基因和特定组织的反转录和实时定量聚合酶链反应。ＲＮＡ分别从西红柿的根，籽苗，叶子，花序，萼片，花瓣，雄蕊，心皮，未成熟果实，断路器果实，黄果，成熟果实（包括种子）用参照生产说明的试剂盒法提取。ｃＤＮＡ是由总RNA利用Superscript III方法根据厂商的说明。为３６个西红柿MIKC c ＭＡＤＳ－Ｂｏｘ基因的特定基因设定引物。肌动蛋白被用于作为每一种组织类型的正控制。引物对的扩增的最佳退火温度和线性范围已经决定了。根据这些测定，PCR在最佳退火温度55-60℃下扩增24-32个循环。

结果

QVT引物设计

退化正向引物的设计是识别13个氨基酸的高度保守伸展在MADS box of MIKCc-类型MADS-box 基因的被子植物中。这个区域被称为QVT区域在序列的第三个氨基酸后。QVT范围的鉴定是由比较来自2002年9月份的GenBank的308个全长的被子植物MADS区域序列的MADS区域的氨基酸序列。成群的相似QVT序列的回译导致总共7个退化的ＱＶＴ引物可以被用于多聚胸腺嘧啶引物去扩增ＭＩＫＣｃ类型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因。

除了３个情况，被用于设计ＱＶＴ引物的初始３０８个序列之间至少有一条有不超过２ｎｔ的差别。为了确定引物设计的粗糙，添加了新的ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因。用存在于ＧｅｎＢａｎｋ中的全部ＭＡＤＳ－ｂｏｘ序列，重复了用于发展ＱＶＴ引物的研究。在此时，我们的研究导致了附加的５６８个被子植物的ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因。总共达到了８７６个。将这些新的５６８个ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因的ＱＶＴ区域和ＱＶＴ引物比较发现，就像最初的设计一样，差不多全部的序列与其中的一个ＱＶＴ引物有不超过２ｎｔ的差别，而且大多数序列精确的符合至少一条ＱＶＴ引物序列。这里有５个例外，一个大米的登记号为ＣＡＥ０５６０６与ＱＶＴ１有５ｎｔ的区别。然而，这个登记包含一个ＭＡＤＳｂｏｘ但是没有Ｋ区域。表明这不是一个MIKC类型MADS-box基因。一个拟南芥的登记号（AAN52796）与QVT2有3nt的不同。这个登记与AGL相符合，它是一个MIKC*类型MADS-box基因。芦笋龙须菜的登录号（AAA18768）与QVT3有3nt的差异。这个登记没有足够的序列数据证明除了MADS box意外还有没有K区域的存在。一个向日葵的登录号（AAO18230）与QVT5有4个nt的差异。这个登记和MIKC类型MADS-box基因相符合。最后，除了拟南芥PISTILLATA

序列在之前的研究中发现外，还有两个附加的PISTILLATA登录号来自于拟南芥和芥菜分别包含4-5个nt与QVT6之间的差异。

概念验证：MIKC类型MADS-box基因来自于拟南芥

为了确定引物QVT1-7的效能，与多聚胸腺嘧啶相结合，为了放大MICK c类型MADS-box基因，首先应用退化引物方法与拟南芥中。依据先前的工作和拟南芥的基因组序列，共有39个MICK c类型MADS-box基因在拟南芥基因组中。期望全部的MICK c类型MADS-box基因都能在QVT1引物下扩增。其中一个基因，AGL24，期望在QVT2下扩增。4个与QVT3相符合的基因。个拟南芥MICK c类型MADS-box基因期望在QVT4扩增。没有与QVT5相符合的，2个与QVT6符合，6个与QVT7符合。39个中有37个拟南芥MICK c类型MADS-box基因在QVT引物下被重新找到。AGL13和AGL71没有重新获得。AGL71的表达形式特别限制。它的表达只有在发芽的籽苗中才能发现。考虑到组织取样策略，可以解释我们无法去重新获得。AGL13，相反，在我们的策略下我们不知道他表达的方式会限制它的成功扩增。而且AGL13的QVT区域序列跟我们的QVT引物也没有显著的不同。事实上，利用QVT引物去扩增包含克隆AGL13序列的质粒重建实验室成功的，表明QVT引物在重新获得AGL13基因是有效的。

QVT引物在单个成功来看在MICK c类型MADS-box基因要比全部相似是可以预期的。观测的QVT引物更广大的应用MICK c类型MADS-box基因很可能由于高度的核苷酸序列相似性在QVT引物中。

在大多数情况下，从预测的拟南芥组织类型中我们可以重新获得MICK c类型MADS-box基因。Parenicova et al报道了一个来自于根，叶，花序，长角果的拟南芥MADS-box基因表达谱。我们抽样更广泛并且在一个出色的发展规模下。但是通过结合结果和我们的来自于莲座丛和茎叶，和来自于早期和晚期的花的抽样，我们可以比较我们的MADS-box基因恢复数据和报导在Parenicova 研究的叶和花序的表达系谱。总之，拟南芥MICK c类型MADS-box基因在全部预期的组织类型中已经重新获得了。然而也有一些例外，包括AGL24, AG, SEP4, AGL18, AGL24, AGL63, 和AGL72，仅仅从一些预测的组织的子集中重新获得。在很多情况下，拟南芥的MICK c类型MADS-box基因在额外的没有被报导的组织中重新获得。这些观测表明我们所用的方法可能更加的有效在验证一斤表达极地水平下。

从西红柿中隔离MICK c类型MADS-box基因

退化引物，RT-PCR方法被用于分离异常的西红柿MICK c类型MADS-box基因。QVT1-7引物，与多聚胸腺嘧啶相结合的反式引物，被用于去扩增来源于多种西红柿组织类型的cDNA的MICK c类型MADS-box基因。这些PCR产物被克隆，测序，MICK c类型MADS-box基因被鉴定。在原先MADS-box基因筛选循环的基础上，克隆PCR池随后用高通量筛选为了额外的MICK c 类型MADS-box基因可能一比价低的频率存在。利用这种方法，我们重新获得了24个西红柿MICK c类型MADS-box基因，其中有7个事先在文献中已经报道了，17个是先前不典型的。总共12个西红柿MICK c类型MADS-box基因被知道了，不论是从文献中还是表达序列标签收集，在本次研究中没有被重新获得。总计来看，有36个独特的西红柿MADS-box基因。这个数目的处理是可能预期的，考虑到39个和47个MICK c类型MADS-box基因分别在拟南芥和水稻基因组中。

先前在本研究中西红柿MICK c类型MADS-box基因的报道包括TAGL1，TAGL11，TAGL12，TM4,TM5，SlMBP7。SlMBP7和LeFUL2相一致，但是在编码序列碳端含有1-bp的插入缺失。