流式细胞分离细胞

流式细胞仪分离原理和步骤

流式细胞术（flow cytometer,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。本实验以间接免疫荧光标记法为例。

实验原理

因淋巴细胞表面有特征性的抗原或受体表达，故先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，经流式细胞仪测定荧光强度和阳性百分率，即可知相应抗原的密度和分布。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

材料和仪器

1 特异性鼠抗人单克隆抗体（McAb）（如抗CD3、抗CD4等）、荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体、灭活正常兔血清，含10％FBS的FBS的RPMI-1640溶液、DPBS、洗涤液、固定液等。

2 玻璃管、塑料离心管、离心机、流式细胞仪、倒置显微镜。

实验方法

1 制备活性高的外周血单个核细胞悬液，用含有10％FCS的RPMI-1640溶液调整细胞浓度为5×106~1×107/mL。

2 取40μL细胞悬液加入预先有特异性鼠抗人McAb 5~50μL的小玻璃管或塑料离心管中，再加50μL 1：2（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4℃，30min。

3 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min，弃去上清液。

4 加入50μL工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记二抗，充分振荡，4℃，30min。

5 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min。

6加1mL固定液，混匀，上流式细胞仪分选细胞。标本在试管中可保存5~7天。