[医学]流式细胞术的临床应用
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AIDS
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
HLA-B27
试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血 检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27
定性检测
实验诊断科 分子诊断组
实验诊断科 分子诊断组
HLA-B27
临床意义：强直性脊柱炎（高度相关） 遗传性关节炎
Reiter’s 综合征 反应性关节炎、银屑病关节炎 急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、
实验诊断科 分子诊断组
FCM的临床应用
标本染色的一般方法 已开展的临床项目 其他临床应用
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊 液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细 胞。
血清和各类体液样本（可溶性蛋白）
实验诊断科 分子诊断组
前期处理
CSF、BALF、胸腹 水等：
其他临床应用
TH1/TH2细胞检测 血小板活化 炎症感染指标CD64 CBA 网织红细胞/血小板检测 微小残留病灶（MRD） 肿瘤细胞倍体（DNA） 细胞凋亡
……
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
淋巴细胞亚群
试剂：BD IMK-Lymphocyte Kit 标本：外周血（常用） 检测指标：T细胞（CD3、CD4、CD8）
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
CD55、CD59
试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本：外周血（红细胞、白细胞） 检测指标：CD55、CD59百分比
CD55、CD59荧光强度
实验诊断科 分子诊断组
CD55、CD59
临床意义：
阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）
酸化血清溶血试验（Ham’s试验）
过滤、离心后制 成单细胞悬液，并调 整目标细胞浓度约 106/ml
骨髓、红ຫໍສະໝຸດ Baidu胞：
调整样本中目标 细胞浓度106/ml
抗体孵育
50～100l标本 (血小板1～5l)
+ 荧光抗体
室温，避光，抗 体孵育20min
(胞内因子检测 需置4℃)
胞 胞内抗原检测：
内 染 色
按照说明书加入固定剂、 破膜剂及胞内荧光抗体，避光 反应30~40min。
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
设门（gating）：
根据某些特性将分析细胞群 圈起来。
淋巴细胞：FSC/SSC CD45++/SSCdim
T淋巴细胞：CD3+/SSCdim
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
直方图
单参数分析 横坐标：信号强度 纵坐标：细胞数量
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
散点图
双参数分析 横、纵坐标代表的均是信号强度 UL: cd3-cd4+ UR: cd3+cd4+ LL: cd3-cd4- LR: cd3+cd4-
B细胞（CD19） NK细胞（CD3-CD16＋56＋）
实验诊断科 分子诊断组
实验室报告
医生报告
实验诊断科 分子诊断组
淋巴细胞亚群
临床意义：体内免疫状态 判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染
SCID、AIDS、 SLE、RA 急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤 免疫球蛋白缺乏症或分泌过多
结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变
糖水试验
蛇毒因子溶血试验
补体溶血敏感实验
FCM检测（金标准）
实验诊断科 分子诊断组
以红细胞检测为例
normal
PNH
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
造血干细胞计数
试剂：BD Procount™ Progenitor Cell Enumeration Kit
标本：骨髓、动员后的外周血 检测指标：CD34＋％及浓度
溶血
如果需要破坏 样本中红细胞：
加入1ml 红细胞裂解液 避光，10min
离心弃上清， 加入PBS，混 匀后离心，弃 去上清用400 l PBS充悬， 避光待上机。
洗涤 上机
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞术的临床应用
已开展的项目
淋巴细胞亚群 HLA-B27 CD55、CD59检测 CD34造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型 杂项（BALF、胸腹水等 CD分子检测）
FSC检测器
SSC检测器
实验诊断科 分子诊断组
外周血裂红后FSC/SSC分布 R1: 淋巴细胞 R2: 单核细胞 R3: 中性粒细胞 R4: 裂解碎片
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号？
荧光信号
抗原抗体反应 单克隆荧光抗体标记
抗原
激光束
细胞
抗体
荧光素
实验诊断科 分子诊断组
常用荧光素
不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激 发光波长有所不同
计算机分析 实验诊断科 分子诊断组
BD FACSCalibur 双光源，488nm和633nm 可同时检测四种抗原 可分选（理论上）
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号？
散射光信号
前向散射光（forward scatter light, fsc ） 反映细胞大小
侧向散射光（side scatter light, ssc） 反映细胞内部颗粒、核膜等
数量的检测 采集时机的确定
某些肿瘤
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型
试剂：各种单克隆荧光抗体 标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织 检测指标：我室目前开展了将近40种指标的检测
可满足大部分L&L的分型要求
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞仪？
六种技术：激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、电子计算机技术、 细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术
四个系统：液流系统、光学系统、 电路系统、分析系统
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪构造
包括流动室、 鞘液和样本流
激光源
滤光片 （长通、短通、带通）
信号检测器
流式细胞术的临床应用
流式细胞术介绍
流式细胞仪 常用荧光素 数据分析
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞术？
利用流式细胞仪（flow cytometry, FCM）对处在快速、 直线、流动状态中的单个微粒多参数、快速定量分析， 也可以同时对特定群体进行分选的技术 分析对象包括细胞、细菌、荧光微球等，0.4m~40m
实验诊断科 分子诊断组
蓝色－荧光微球（数量已知）；红色－CD34＋细胞
干细胞特征：
CD45表达弱→阴性 (R2) CD34表达弱→强 (R4) DNA/RNA含量多，染色性较强 (R1) 大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似
实验诊断科 分子诊断组
造血干细胞计数
临床意义： 血液系统疾病的造血干细胞移植
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
HLA-B27
试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血 检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27
定性检测
实验诊断科 分子诊断组
实验诊断科 分子诊断组
HLA-B27
临床意义：强直性脊柱炎（高度相关） 遗传性关节炎
Reiter’s 综合征 反应性关节炎、银屑病关节炎 急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、
实验诊断科 分子诊断组
FCM的临床应用
标本染色的一般方法 已开展的临床项目 其他临床应用
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊 液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细 胞。
血清和各类体液样本（可溶性蛋白）
实验诊断科 分子诊断组
前期处理
CSF、BALF、胸腹 水等：
其他临床应用
TH1/TH2细胞检测 血小板活化 炎症感染指标CD64 CBA 网织红细胞/血小板检测 微小残留病灶（MRD） 肿瘤细胞倍体（DNA） 细胞凋亡
……
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
淋巴细胞亚群
试剂：BD IMK-Lymphocyte Kit 标本：外周血（常用） 检测指标：T细胞（CD3、CD4、CD8）
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
CD55、CD59
试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本：外周血（红细胞、白细胞） 检测指标：CD55、CD59百分比
CD55、CD59荧光强度
实验诊断科 分子诊断组
CD55、CD59
临床意义：
阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）
酸化血清溶血试验（Ham’s试验）
过滤、离心后制 成单细胞悬液，并调 整目标细胞浓度约 106/ml
骨髓、红ຫໍສະໝຸດ Baidu胞：
调整样本中目标 细胞浓度106/ml
抗体孵育
50～100l标本 (血小板1～5l)
+ 荧光抗体
室温，避光，抗 体孵育20min
(胞内因子检测 需置4℃)
胞 胞内抗原检测：
内 染 色
按照说明书加入固定剂、 破膜剂及胞内荧光抗体，避光 反应30~40min。
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
设门（gating）：
根据某些特性将分析细胞群 圈起来。
淋巴细胞：FSC/SSC CD45++/SSCdim
T淋巴细胞：CD3+/SSCdim
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
直方图
单参数分析 横坐标：信号强度 纵坐标：细胞数量
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
散点图
双参数分析 横、纵坐标代表的均是信号强度 UL: cd3-cd4+ UR: cd3+cd4+ LL: cd3-cd4- LR: cd3+cd4-
B细胞（CD19） NK细胞（CD3-CD16＋56＋）
实验诊断科 分子诊断组
实验室报告
医生报告
实验诊断科 分子诊断组
淋巴细胞亚群
临床意义：体内免疫状态 判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染
SCID、AIDS、 SLE、RA 急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤 免疫球蛋白缺乏症或分泌过多
结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变
糖水试验
蛇毒因子溶血试验
补体溶血敏感实验
FCM检测（金标准）
实验诊断科 分子诊断组
以红细胞检测为例
normal
PNH
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
造血干细胞计数
试剂：BD Procount™ Progenitor Cell Enumeration Kit
标本：骨髓、动员后的外周血 检测指标：CD34＋％及浓度
溶血
如果需要破坏 样本中红细胞：
加入1ml 红细胞裂解液 避光，10min
离心弃上清， 加入PBS，混 匀后离心，弃 去上清用400 l PBS充悬， 避光待上机。
洗涤 上机
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞术的临床应用
已开展的项目
淋巴细胞亚群 HLA-B27 CD55、CD59检测 CD34造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型 杂项（BALF、胸腹水等 CD分子检测）
FSC检测器
SSC检测器
实验诊断科 分子诊断组
外周血裂红后FSC/SSC分布 R1: 淋巴细胞 R2: 单核细胞 R3: 中性粒细胞 R4: 裂解碎片
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号？
荧光信号
抗原抗体反应 单克隆荧光抗体标记
抗原
激光束
细胞
抗体
荧光素
实验诊断科 分子诊断组
常用荧光素
不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激 发光波长有所不同
计算机分析 实验诊断科 分子诊断组
BD FACSCalibur 双光源，488nm和633nm 可同时检测四种抗原 可分选（理论上）
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号？
散射光信号
前向散射光（forward scatter light, fsc ） 反映细胞大小
侧向散射光（side scatter light, ssc） 反映细胞内部颗粒、核膜等
数量的检测 采集时机的确定
某些肿瘤
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型
试剂：各种单克隆荧光抗体 标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织 检测指标：我室目前开展了将近40种指标的检测
可满足大部分L&L的分型要求
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞仪？
六种技术：激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、电子计算机技术、 细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术
四个系统：液流系统、光学系统、 电路系统、分析系统
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪构造
包括流动室、 鞘液和样本流
激光源
滤光片 （长通、短通、带通）
信号检测器
流式细胞术的临床应用
流式细胞术介绍
流式细胞仪 常用荧光素 数据分析
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞术？
利用流式细胞仪（flow cytometry, FCM）对处在快速、 直线、流动状态中的单个微粒多参数、快速定量分析， 也可以同时对特定群体进行分选的技术 分析对象包括细胞、细菌、荧光微球等，0.4m~40m
实验诊断科 分子诊断组
蓝色－荧光微球（数量已知）；红色－CD34＋细胞
干细胞特征：
CD45表达弱→阴性 (R2) CD34表达弱→强 (R4) DNA/RNA含量多，染色性较强 (R1) 大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似
实验诊断科 分子诊断组
造血干细胞计数
临床意义： 血液系统疾病的造血干细胞移植