流式细胞术的原理与应用

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检测系统
电路 电压调节
• 光电倍增管 • 电压 volts • 增益 Gain • 信号放大方式
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检测系统
• 电信号输入到放大器放大，放大器分两 类：线性放大和对数放大。
• 细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般 选用线性放大测量。
• 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜 表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚 至几万倍，通常使用对数放大器。
650 Short Pass 550 Long Pass
(600SP)
(650LP)
Transmitted <650 nm Diflected 90? >650 nm
>550 nm <550 nm
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光学系统 流式细胞仪光路图
Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses
分析的理想光源。由于细胞快速流动，
每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右， 每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧
光信号强弱，与被照射的时间和激发光
的强度有关，因此细胞需要足够的光照
强度。
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光学系统
信号
• 散射光信号
FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性
• 荧光信号
FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5
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液流系统
流动室
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
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光学系统
激光光源：目前台式机FCM，大多采用 氩离子气体激光器。激光(laser)是—种 相干光源，它能提供单波长、高强度及
稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速
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常用荧光染料介绍
• FITC：
绿色
• PE：
橙黄色
• ECD：
橙红色
• PE－CY5：
深红色
• PerCP：
深红色
• PE－CY7：
深红色
• 7AAD：
深红色
• PI(碘化丙啶）：
橙红色
– 488nm波长的氩离子激光激发
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525nm 575nm 610nm 675nm 675nm 755nm 675nm 620nm
流式细胞术原理和应用
王秀莉 2011.9.30
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一 简介
二 构造及工作原理
三 FCM的数据分析
四 FCM的应用
五 实例
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一 简介
流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技 术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技 术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为 一体的高科技细胞分析仪。
620BP FL3 (ECD) 575BP FL2 (PE) 525BP FL1 (FITC)
675BP FL4 (PC5)
Side Scatter Detector
645DL
600DL 550DL
488BK 488DL
High Sensitivity Quartz Flow Cell
Forward Scatter Detector
统计 （分析系统） • 计算机
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液流系统
• 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激 光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻 璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔， 供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流 动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照 时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角 收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。
2 流式细胞术的科研应用
• 细胞大小 • 细胞的颗粒度 • 细胞表面分子：CD 系列 • 细胞浆内分子：胞内细胞因子 • 细胞核内分子：P53 • 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
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1） 蛋白表达的检测
荧光信号的定量可以用 平均荧光强度（mean
值），荧光信号面积（可编A辑rpepta，A）来表示。
SHOR(5T00nm)
(600SP)
(650LP)
(600/100)
Transmitted <650 nm
>550 nm
550 - 650 nm (600?0)
Blocked >650 nm
<550 nm
<550 nm & >650 nm
LONG(700nm)
Dichroic Filters
SHORT(500nm)
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光学系统 散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性
FS
SS
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光学系统
光路 （滤片特性）
Wavelengths
LON(G700nm)
Short Pass Long Pass
Band Pass
Pass Through
Filters
650 Short Pass550 Long Pass 600/100 Band Pass
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用 流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞 或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和 分选的技术。
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流式细胞仪的特点
单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和
分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒
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3. 等高线图
4. 密度图
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四 FCM的应用
1 流式细胞术的临床应用
• 白血病免疫分型 • HLA-B27: 强直性脊柱炎 • 淋巴细胞亚群 • 造血干细胞计数：造血干细胞移植 • 网织红细胞 • PNH诊断（CD55、CD59） • 血小板活化试验
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Baidu Nhomakorabea
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光路补偿
FITC/PE/ECD/PC5
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三 FCM的数据分析
1. 单参数一维直方图
纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光 信号或散色光信号值，单位是道数。
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2. 双参数二维点图
显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。 横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别 计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。
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举例：细胞周期分布检测
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二 构造及工作原理
流路 (液流系统） • 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统） • 光源 • 滤片
电路（检测系统） • 光电倍增管PMT • 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换