鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
实验九：鸡胚成纤维细胞的制备
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，
收集滤液。
（三）分装与培养
1、细胞计数 用细胞计数器计数，根据计数结果，加入 DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个
/ml。（本实验省略此步）
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL
的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液
0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细
胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日
期，置37℃温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-
36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种
病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免 影响细胞的贴壁和生长。本实验培养3天，培养期 间可每天观察1次。3天后取出，洗净培养瓶，放 回实验室。
要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断
必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培 养物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个 细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第 一次传代培养为原代培养。
本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细 胞，通过细胞培养实践操作，认识和体 会原代细胞的制备方法和影响细胞培养
本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞通过细胞培养实践操作认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养的主要因素并掌握原代细胞培养的方四实验步骤一操作前的准备1预热培养液
实验九 鸡胚成纤维细胞的制备
一、实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
二、试验器具、试剂、仪器
（四）细胞形态观察
检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表 示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。 37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可 以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
鸡胚成纤维细胞的制备
实习三鸡胚成纤维细胞（CEE）的制备目的：1.初步掌握CEE的培养方法和待染色的细胞培养物的制备。
2.了解一般细胞培养要求的条件。
材料：10~12天龄鸡胚、BSS（每100ml加3.5%NaHCO3和庆大霉素各1.0ml）、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清5ml、庆大霉素1ml）、小牛血清、0.06%胰酶、3.5%NaHCO3、庆大霉素（5000单位/ml）、蛋架、剪刀、镊子、铁线钩、烧杯、三角瓶、、链霉素瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、培养架、酒精灯、酒精棉、漏斗及尼龙滤网、离心管、天平、平衡杯、离心机、羊皮纸、1/2盖玻片等。
内容与方法：1．准备好平皿、烧杯、三角瓶、细胞瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、漏斗子，及尼龙滤网、离心管、1/2盖玻片等。
预先包扎好，15磅30分高压灭菌。
小铁钩、剪刀和镊子等可在用前煮沸15分钟。
2．用碘酒棉和酒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，钩起鸡胚，在平皿内剪去头、脚及去掉内脏，然后放入烧杯内，并尽量剪碎胚体。
3．用约10ml BSS将组织碎块倒入三角瓶，并冲洗2次，以除去其中的红细胞。
4．加入0.06%胰酶10ml，于37℃水浴消化约10分钟，迅速用BBS将组织碎块轻轻冲洗2次，最后一次冲洗液弃去后即加10ml营养液（营养液里的血清将终止残存胰酶的作用），用吸管反复吹打组织碎块，直至大部分细胞分散而上层液变浑浊。
5．经100目尼龙滤网滤入离心管，并用羊皮纸封口，平衡后1000r/min离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新的营养液，然后重新悬浮细胞。
6．每一细胞瓶加入细胞悬液；制备待固定、染色的细胞培养物可在瓶内加入半块盖玻片，使其浸入细胞悬液中。
在瓶上方做上标记，置37℃培养，1~2天后CEE可生长形成单层。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞的制作及培养鸡胚成纤维细胞培养1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10,15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，加入适量含有血清的培养液。
10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO调整。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
CEF、DEF培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。
第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。
静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。
必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
鸡胚成纤维细胞制备
取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。
将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。
最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。
抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。
经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。
体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。
抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。
这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。
效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。
然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。
鸡胚成纤维细胞制备优秀课件
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚成纤维细胞制备
鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备材料准备：干烤好的漏斗，高压好的12层纱布，50ml的烧杯，锥形瓶，剪刀，镊子，平皿，Hank’s液，含10%血清的199培养基，胰酶，19日龄SPF鸡胚（CEK细胞），9日龄SPF 鸡胚（CEF细胞）。
取胚：用新洁尔灭对鸡蛋外壳进行消毒，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75%酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。
取组织：取小烧杯，倒入适量微温Hank’s液，将鸡胚仰放，制备CEK细胞除去胃、肠、肝脏、肺脏、心脏等器官，用小镊子将嵌入在脊椎两侧的肾脏取出，浸泡在Hank’s液中；制备CEF细胞去掉头、翅膀、腿和内脏，将剩余的胴体放入50ml的烧杯。
漂洗，剪碎：用Hank’s也漂洗3次，将组织脏器剪成1mm3左右的小块，再用Hank’s液漂洗3次。
胰酶消化：将小烧杯中的组织小块移到锥形瓶中，加入适量37℃水浴加热的胰酶溶液，放在水浴锅中消化30-35min。
终止消化：待组织体积增大、边缘出现毛边停止消化，小心倒出胰酶，用Hank’s液洗3遍。
制备细胞：除去Hank’s液，加入适量含10%血清的199培养基，剧烈震荡，将液体倒入含12层纱布的漏斗，重复数次，一般按1个胚加入25mL培养基来计算培养基总量。
活细胞计数：用血球计数板进行台盼兰细胞计数。
用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计数板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打，混匀细胞悬液；用微量移液枪从盖片边缘滴加20μL细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中；勿使液体漫过盖片或出现气泡；镜下观察并计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右侧和下方的不计算在内；细胞数/毫升原液=(4大格细胞数/4)×10000×稀释倍数。
每4个大方格计数，以80-120个为宜。
未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，进行活细胞计数：用台盼兰染色进行活细胞计数后，调整CEK、CEF细胞密度至100×104个/mL左右，25cm2塑料细胞培养瓶中接入8mL细胞分散液，置于37℃细胞培养箱静置培养。
鸡胚成纤维细胞(CEF)制备
取9~11日龄SPF鸡胚，分别用碘酒和酒精棉由鸡胚中央向四周擦拭消毒，然后放入超净台，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子磕破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，注意不让蛋壳碎屑落入蛋内，换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入胚内夹住鸡胚颈部取出，放入平皿中，将取出的鸡胚去脑、四肢、内脏，放入一小烧杯中，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm3左右的小块，再用PBS清洗3遍，至组织块发白为止。
将剪碎的组织块移入另一小烧杯中，加入适量的（1ml左右）0.5%胰酶和9mlPBS，于37℃水浴中消化10min左右。
倒掉PBS和胰酶混合液然后加入生长液25ml终止消化，用枪头充分吹打成单个细胞。
再用8层灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬浮液稀释10倍，使细胞终浓度达到50万个/ml，每个细胞瓶加入8ml。
放入CO2培养箱中，37℃培养24小时，直至细胞长成单层致密，及可以接毒。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚成纤维细胞原代培养与纯化的初探
１． ． ６冰箱 ： ２ 阿里斯 顿。
１３ 主 要试 剂 ．
Ｐ Ｓ液 ； Ｍ Ｍ 培 养 基 ；． ％胰 蛋 白酶 ；． ％Ｅ — Ｂ Ｄ Ｅ Ｏ５ ２ ０ ２ Ｄ ０
Ｔ — ａ１０ Ｉ ｌ Ａ Ｎ ； Ｕ／ 的青 、 ０ ｍ 链霉素溶液 ； 灭活的血清 ； 双蒸水 ；
三蒸水 。
２ 实 验方 法
器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 。美国 Ｅ ｄｔｎｅ ｎｏ ｏｉ公 ｒ
司用 中空 纤维 生物反应 器大规 模培养 动物 细胞生 产 出免 疫 球 蛋 白 Ｇ Ａ、 和尿激 酶 、人 生长激 素等 。美 国 Ｇ ｎｎ ｅ 、 Ｍ ｅｅｔ ｈ ｅ 公 司应 用 Ｓ ４ Ｖ ０为载体 ，将 乙型 肝炎 病毒 表 面抗 原 基 因插
１． ． ５倒置 显微镜 ： ２ 上海 照相机三 厂 。
维细胞在一定生理状态下所需的各种条件 。体外培养 的细 胞在培养条件下便于控制条件 ， 可以做一些非常精确 的细
胞生 物学研 究 ， 胚成纤 维细胞 的原代 培养 在分 子生物 学 ， 鸡
细胞学 ， 遗传学 ， 免疫学 ， 病毒学， 肿瘤学 ， 及细胞工程学等
２ １ 胚成纤 维细胞 的原代 培养 ．鸡 ２ １１取材 ．．
生成素 、单克隆抗体等产品。该技术经从使用转瓶（ｌｒ ｒｌ ｏｅ
ｂｔｅ 、ｅＣ ｂ 等 贴 壁 细 胞 培 养 ，发 展 为 生 物 反 应 器 ｏｌ Ｃｌ ｕ ｅ ｔ） ｌ
（ｉ ｅｅ ｒ进行大规模细胞培养 。由于动物细胞培养技术 Ｂｏ ａｔ ） ｒ ｏ
领域 口 ， 展成 为一 门重 要 的生物技 术 ， 得显 著成 就 ， ｌ 发 ４ 并取 因而 细胞培养 是探索 和指示 细胞生命 活动规 律 的一种 简便 易行 的实验技 术 。 随着 细胞 培养 的原理 与方法 日 完善 ， 臻 动物 细胞 大规 模培养 技术趋 于成熟 。 十数年来 ， 功生产 了包括 狂犬 近 已成 病疫苗 、 疫疫苗 、 口蹄 甲型肝炎 疫苗 、 乙型肝炎 疫苗 、 细胞 红
实验八 病毒鸡胚接种与细培养
兽医微生物实验教学课件
（动物医学本科专业）
动物医学系
实验八 病毒鸡胚接种与培养
目的要求：
1、了解不同日龄鸡胚接种的途径和应用。 2、掌握鸡新城疫病毒鸡胚尿囊腔接毒、收毒方法。 3、掌握鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒分离培养
分离培养：动物接种——原动物/实验动物 鸡胚接种——尿囊腔、卵黄囊、尿囊膜、羊膜腔等
细胞培养——原代细胞
二倍体细胞 传代细胞
cpe观察空斑ຫໍສະໝຸດ 基因克隆/扩增组织块培养——肠管、气管环等
鸡 胚 成 纤 维 细 胞 培 养 程 序 ：
在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚 ↓ 除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块 ↓ 用Hanks液等充分冲洗 ↓ 剪将其剪成lmm大小的碎块 ↓ 加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗 ↓ 约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8 ↓ 37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次 ↓ 吸弃上层胰酶溶液 ↓ 用洗液轻洗2次后 ↓ 吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液 ↓ 准备细胞计数 ↓ 单层细胞培养
实验内容：
1、鸡胚的选择和接种途径：鸡胚发育正常时，可见清晰的血管和活 的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。 卵黄囊接种：6-8日龄的鸡胚； 绒毛尿囊腔接种：9-13日龄的鸡胚； 鸡胚血管注射：12-13日龄鸡胚； 羊膜腔和脑内注射：10日龄鸡胚。 2、鸡新城疫病毒接种液或接种病料的处理；照蛋、打孔；接种。接 种后的检查和收毒。 3、鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
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鸡胚成纤维细胞培养
1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、
75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新
洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先
置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的
胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器
消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培
养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
分装在细胞培养瓶中。
视细胞多少而定加入培养基。
培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液.
11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。
瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易
生霉菌，每次换液时需要换新塞。
培养24小时进行观察。
一般在24－48小时可形成单层细胞。
传代
1. 倾倒培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。
3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。
注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。
5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。