重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白_的发酵pH优化
基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白_刘斌
第35卷第4期2011年8月南京理工大学学报Journal of Nanjing University of Science and TechnologyVol．35No．4Aug．2011收稿日期：2010－09－20修回日期：2011－06－10基金项目：国家“863”计划资助项目（2008AA12A218）；教育部博士点基金（20093219110013）作者简介：刘斌（1971－），男，博士生，主要研究方向：基因工程技术的应用，E-mail ：goldendays2002@126．com ；通讯作者：杨树林（1953－），男，教授，博士生导师，主要研究方向：微生物代谢调控与基因工程，E-mail ：yshulin@mail．njust．edu．cn 。
基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白刘斌，郭红丽，钮小松，张小霞，杨树林（南京理工大学环境与生物工程学院，江苏南京210094）摘要：通过响应曲面法（RSM ）优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。
采用Box－Behnken 设计（BBD ）考察初始诱导pH 值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响，利用DX7Trial 软件设计实验方案，根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。
响应面分析确定的最优因素水平组合为：初始诱导pH 值为5．0，诱导温度为28ħ，甲醇添加量为2．2%/24h 。
通过响应面法优化发酵的内在因素水平，找出最佳条件，为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。
关键词：巴氏毕赤酵母；重组人源胶原蛋白；响应曲面法；Box-Behnken 设计中图分类号：Q815文章编号：1005－9830（2011）04－0558－05Optimization of Fermentation Conditions of Genetically Engineered Pichia pastoris Expressing Recombinant Human-source CollagenLIU Bin ，GUO Hong-li ，NIU Xiao-song ，ZHANG Xiao-xia ，YANG Shu-lin（School of Environmental and Biological Engineering ，NUST ，Nanjing 210094，China ）Abstract ：Response surface methodology （RSM ）is used to optimize the fermentation conditions of ge-netically engineered Pichia pastoris （GS115/pPIC9KG6）expressing highly hydrophilic recombinant human-source collagen．Box-Behnken design （BBD ）is introduced to estimate the impact of initial in-ducement pH ，temperature and addition amount of methanol．An experiment is done by setting differ-ent culture conditions according to the scheme designed through the DX7Trial software ，and the cor-relational parameters are determined．The RSM analysis result shows that the optimal scale of factors is ：initial inducement pH 5．0，temperature 28ħ，addition amount of methanol 2．2%/24h．The ex-periment offers precise conditions for high density fermentation performed in fermenter．Key words ：Pichia pastoris ；recombinant human-source collagen ；response surface methodology ；Box-Behnken design总第179期刘斌郭红丽钮小松张小霞杨树林基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白胶原蛋白具有独特的组织结构和生物学特性，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用，同时胶原蛋白具有低免疫原性、可生物降解、良好的生物相容性和机械性能等特点，作为生物医用材料广泛应用于医药、组织工程和化妆品等领域［1，2］。
重组Ecoli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化
重组Ecoli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化西北大学博士学位论文重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化姓名：薛文娇申请学位级别：博士专业：生物化工指导教师：范代娣20090610西北大学博士学位论文中文摘要本研究旨在建立一套完整的重组Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ生产类人胶原蛋白（ｈｕｍａｎ．１ｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ．ＨＬＣ）的中试规模生产工艺，并通过对各单元操作从实验室规模到中试规模的放大研究，为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。
重组Ｅｃｏｌｉ的高密度培养是ＨＬＣ生产过程的核心单元，其放大的成功与否直接关系到整个工艺过程。
为了明确影响发酵过程的关键因素，从而选择合适的放大准则和方法，本文对发酵过程中二氧化碳和乙酸的影响进行了系统研究。
尽管有大量文献表明，二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ发酵有负面影响，然而关于二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ，特别是重组蛋白表达方面的定量研究却未见报道。
本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组Ｅｃｏｌｉ生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。
研究结果表明，当在分批培养阶段施加浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲时，细胞生长明显受到抑制；而在补料阶段引入该脉冲时，却引起了比生长速率的小幅上升；二氧化碳对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段，即在蛋白表达诱导阶段引入浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲３小时，则最终ＨＬＣ浓度下降３３．９％。
尽管二氧化碳脉冲的浓度越高，作用时间越长，其相应的抑制或促进作用也越明显，但当二氧化碳脉冲浓度小于等于１０％时，对发酵过程却几乎没有影响。
然后，针对重组Ｅｃｏｌｉ发酵过程的关键问题一乙酸抑制作了系统研究。
研究结果表明，在分批培养阶段乙酸对Ｅｃｏｌｉ细胞有明显的抑制作用，但在补料培养阶段，其影响却并不明显；而乙酸对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段。
本文首次建立了这一评价重组Ｅｃｏｌｉ细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。
小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定
发酵工程工艺原理实验报告小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定学校：华南农业大学学院：食品学院班级： XX级食品科学与工程X班小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定摘要 为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测DO 值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。
本实验选用生长迅速的大肠杆菌进行发酵罐的培养，同时定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度以及残留还原糖的变化。
关键词 大肠杆菌 发酵前言 发酵过程中，微生物的生长呈一定规律，掌握微生物生长曲线，可以防止菌种老化衰退、防止有害产物积累、提高发酵的效率，对生产有指导意义。
通过测定生化指标，可大体了解菌体生长曲线，并在此基础上采取适当措施促进微生物生长。
生长曲线中，微生物产生代谢产物或抗生素多在对数期末期或稳定期，因此可采取方法延长次期，如通过发酵罐等方法，不断调节培养基的pH 值，去除有害物质，增加适量的气体和营养物质，使微生物延迟进入或不进入衰退期，从而生产出大量的有用的代谢产物[1]。
发酵罐是生化、食品、医药、农药、化工等生产领域的常用设备，虽然发酵罐的类型很多,如自吸式、气升式等。
但发酵工厂用得最多的还是传统的通用发酵罐(机械搅拌发酵罐)[2]。
发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH 、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。
1材料与方法1.1实验流程：菌种斜面一级种子（250mL 摇瓶培养24h 二级种子培养10h 培养12h37℃37℃)(500mL 摇瓶）37℃发酵罐 管路准备 实罐灭菌37℃放罐发酵 8～10h 培养基取样分析测定1.2菌种准备1.2.1配制培养基1)配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa灭菌20min，然后摆成斜面。
重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化
重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化作者：吴铭，郭立泉，陈光来源：《湖北农业科学》 2014年第10期吴铭１，２，郭立泉１，陈光３（１．吉林工商学院粮油食品深加工吉林省重点实验室，长春１３００６２；２．东北师范大学生命科学学院，长春１３００２４；３．吉林农业大学生命科学学院，长春１３００００）摘要：以Ⅵ型人胶原蛋白Ａ２链基因为模板，ＰＣＲ扩增得到目的基因ＣＰ６，构建了重组胶原蛋白表达载体，然后筛选高效表达的宿主菌，检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。
结果表明，重组胶原蛋白在Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达量相对最高，重组质粒稳定性也较高。
较佳的表达条件为接种量４％或５％，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００ｎｍ为０．７时，加入０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，培养５ｈ，并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。
关键词：胶原蛋白多肽；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；表达；优化中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）10－2443-05胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取，将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。
胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同，并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质［１］。
目前，研究者已经发现了很多生物体的多肽，而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节，如神经传导、细胞增殖和生长等。
因此，在胶原蛋白的研究中，胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。
在胶原蛋白的众多类型中，Ⅵ型胶原蛋白（ＣⅥ）几乎分布在所有结缔组织中，而且它还具有维持组织完整性，能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激ＤＮＡ合成，具有生长因子的特性［２，３］。
目前，研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Ｂｅｔｈｌｅｍ肌病的主要原因，而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化，Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。
本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中进行表达研究，为后续研究奠定了基础。
响应面法优化表达丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌培养基
响应面法优化表达丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌培养基姚兵莉;卢俊文;张建国【摘要】本研究利用响应面法优化重组大肠杆菌的培养基提高了其表达丙酮酸氧化酶的产量.首先,单因素优化实验表明pH、甘油浓度、酵母粉浓度、胰蛋白胨浓度分别为pH 7、0.3％、1.2％、0.6％时有利于重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶.进而,利用Box-Behnken法对甘油、酵母粉、胰蛋白胨设计三因素三水平实验,通过响应面回归分析,得到模型预测的最优培养基条件.在0.6％甘油、3.18％酵母粉和0.44％胰蛋白胨的培养基条件下重组大肠杆菌产丙酮酸氧化酶有最高活力.验证试验结果丙酮酸氧化酶活力达到(17 194.9 ±504.9) U/L,与模型的预测值相近,比未优化前提高了1.7倍.本研究结果为丙酮酸氧化酶的大规模生产和工业化应用提供了基础.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2018(048)006【总页数】7页(P25-31)【关键词】丙酮酸氧化酶;大肠杆菌发酵;培养基优化;响应面【作者】姚兵莉;卢俊文;张建国【作者单位】上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093;上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093;上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093【正文语种】中文丙酮酸氧化酶是一种十分重要的试剂用酶[1]，能够用于人体内血清中天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶指标的测定[2]。
但是野生型产生丙酮酸氧化酶的菌株主要来自于绿色气球菌和植物乳杆菌，其丙酮酸氧化酶的产量只有120 U/L[3]。
基因工程构建重组微生物能显著提高外源酶产量[4]。
大肠杆菌是最早用于表达外源酶的系统，具有遗传背景清晰、发酵周期短、营养需求简单等优点[5,6]。
ZHAO 等利用基因工程技术在大肠杆菌中表达丙酮酸氧化酶，活力高达1 748.3 U/L[7]，是天然发酵的14.6倍。
为了获得高密度菌体和高表达的外源酶量，培养基优化是提高发酵产量的重要步骤[8]。
重组胶原蛋白技术研究
重组胶原蛋白技术研究
胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，广泛存在于人体的结缔组织中，包括皮肤、骨骼、血管和软骨等部位。
由于其独特的生物相容
性和生物降解性，胶原蛋白在医学领域中具有广泛的应用前景，包
括组织工程、药物传递系统和伤口愈合等方面。
然而，传统的胶原蛋白提取方式受到限制，因为它们可能含有
致敏原和病原体。
为了克服这些问题，科学家们开发了重组胶原蛋
白技术，这一技术利用基因工程方法将胶原蛋白基因导入到细胞中，通过细胞的表达和分泌来获得高纯度和高质量的胶原蛋白。
重组胶原蛋白技术的研究涉及到多个方面。
首先，科学家们需
要选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞，来
表达胶原蛋白基因。
其次，他们需要设计有效的表达载体，以确保
胶原蛋白基因能够在宿主细胞中得到高效表达。
此外，还需要优化
发酵条件和纯化工艺，以获得高纯度和高产量的重组胶原蛋白。
重组胶原蛋白技术的研究不仅可以为医学领域提供高质量的胶
原蛋白材料，还可以为相关产业的发展提供新的技术支持。
例如，
重组胶原蛋白可以用于制备生物材料，用于组织工程和再生医学研
究。
此外，它还可以用于开发新型的药物传递系统，提高药物的稳定性和生物利用度。
总之，重组胶原蛋白技术的研究具有重要的科学意义和应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信重组胶原蛋白将会在医学和生物工程领域发挥越来越重要的作用。
重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达
重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。
由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。
目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。
丙酮酸类人胶原蛋白重组大肠杆菌响应面优化法发酵论文
丙酮酸论文：通过增大丙酮酸节点的代谢流量来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量【中文摘要】本文主要研究通过在基因重组Escherichia coli BL 21发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ的表达蛋白阶段添加丙酮酸来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量。
并运用响应面优化法对丙酮酸添加过程中影响类人胶原蛋白Ⅱ的产量的因素(丙酮酸的添加量、丙酮酸的添加时间和磷酸缓冲液浓度)进行了摇瓶实验优化。
最终,在磷酸缓冲液浓度是0.17mol/L的发酵培养基中,在诱导时添加8.23mmol/L的丙酮酸得到类人胶原蛋白Ⅱ的产量为0.29g/L,相对于对照实验组增长了11.54%,细胞的OD60¨0也比对照组提高了28.72%。
在摇瓶实验数据的基础上,用发酵罐实验对丙酮酸的添加量、丙酮酸的添加时间这两因素对类人胶原蛋白Ⅱ的产量的影响作了研究。
结果显示：能显著提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量的丙酮酸的添加量为15.84mmol/L,丙酮酸的添加时间为诱导后1小时。
在此条件下,细胞干重和蛋白产量分别达到69.6g/L和11.87g/L。
【英文摘要】Recombinant Escherichia coli BL21 is used to produce human-like collagen.To improve human-like collagen production, pyruvate was added to the zymotic fluid at the phase of expression of human-like collagen. And response surface methodology (RSM) was adopted to optimize the adding time and dosage of pyruvate and the concentration of phosphate buffer.Finally, the adding time of pyruvate was at the point of induction, the optimal dosage of pyruvate and the concentration of buffer were 8.23 mmol·L-1 and 0.17 m...【关键词】丙酮酸类人胶原蛋白重组大肠杆菌响应面优化法发酵【英文关键词】Pyruvate Human-like collagen Recombinant Escherichia coli Response surface methodology Fermentation 【索购论文全文】138113721 139938848 即付即发【目录】通过增大丙酮酸节点的代谢流量来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量摘要3-4Abstract4第一章绪论8-20 1.1 类人胶原蛋白Ⅱ8-9 1.2 增加外源蛋白的表达9-15 1.2.1 发酵工艺条件优化9-11 1.2.2 减少抑制外源蛋白表达的抑制物11-15 1.3 类人胶原蛋白Ⅱ的氨基酸含量及其表达15-17 1.3.1 大肠杆菌和类人胶原蛋白Ⅱ的氨基酸含量15-16 1.3.2 蛋白质负担16-17 1.4 应用Design-Expert7.0软件进行响应面优化17-18 1.4.1 响应面优化法17-18 1.4.2 用Design-Expert7.0软件响应面优化法简介18 1.5 本研究的目的、意义及内容18-20第二章实验材料及方法20-31 2.1 菌种20 2.2 仪器和试剂20-22 2.3 试验方法22-24 2.3.1 菌种活化22 2.3.2 种子培养22 2.3.3 摇瓶实验22-23 2.3.4发酵罐分批-补料培养23 2.3.5 菌体收集23-24 2.3.6 目标蛋白的分离24 2.4 分析方法24-31 2.4.1 菌体浓度(OD)测定方法24 2.4.2 菌体干重测定24 2.4.3 残糖测定24-25 2.4.4 乙酸含量的测定25 2.4.5 有机酸检测(HPLC法)25-26 2.4.6 类人胶原蛋白Ⅱ含量测定26-31第三章添加丙酮酸的摇瓶优化31-52 3.1 引言31 3.2 单因素实验31-32 3.2.1 丙酮酸添加量对类人胶原蛋白产量的影响31-32 3.2.2 丙酮酸添加时间对类人胶原蛋白产量的影响32 3.2.3 磷酸缓冲盐(K_2HPO_4-NaH_2PO_4)浓度对类人胶原蛋白产量的影响32 3.3响应曲面优化法32-33 3.3.1 Planckett-Burman实验32-33 3.3.2 最陡爬坡实验33 3.3.3 中心复合实验33 3.3.4 验证实验33 3.4 实验结果与分析33-51 3.4.1 单因素实验33-36 3.4.2 Planckett-Burman实验结果与分析36-38 3.4.3 最陡爬坡实验结果与分析38 3.4.4 中心复合实验结果与分析38-41 3.4.5 丙酮酸的添加对生物量的影响41-47 3.4.6 丙酮酸的添加对乙酸的影响47-50 3.4.7 验证实验50-51 3.5 本章小结51-52第四章发酵罐培养52-60 4.1 发酵实验设计52-55 4.1.1 发酵参数及发酵方式的选择52-55 4.1.2 添加丙酮酸的实验设计55 4.2 实验结果与分析55-59 4.2.1 丙酮酸的添加量55-58 4.2.2 丙酮酸的添加时间58-59 4.3 本章小结59-60参考文献60-66攻读硕士学位期间取得的学术成果66-67致谢67。
重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化
重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化沈爱萍。
何宝龙。
孙丽慧。
郑裕国(浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014)摘要：核苷磷酸转移酶能够特异地将无机焦磷酸(PPi)的磷酸根转移到核苷5’一位的羟基上，该过程并不需要A T P的参与，且具有选择性高和反应条件温和等特点。
以实验室前期构建的重组大肠杆菌E．∞f f B L21(D E3)／pE T28b—A P／P T为茵株，进行了5L发酵罐中的培养条件优化，确定了以乳糖作为诱导剂时，最佳诱导时机oD鲫为7左右，诱导剂乳糖的浓度为10g／L；确定了最适通气量为1．5L／m i n。
在该条件下，核苷磷酸转移酶酶活达221．4U／L，O D600为20．4。
关键词：重组大肠杆茵；核苷磷酸转移酶；发酵；条件优化O pt i m i zat i on of f e r m e nt a t i on condi t i ons f or t he pr oduct i on ofphosphot r ansf e r as e by E sc her i chi a col iS H E N A i—pi ng，H E B ao—l ong，SU N L i—hui，Z H EN G Y u—guo(I nst i t ut e of B i oengi neer i ng，Zhej i ang U ni vers i t y of t e chnol ogy，H angzhou310014，C hi na)A bst r ac t：P hos phot r ans f e r as e，poss ess ed hi gh r egi o s peci f i ci t y of t he nucl eosi de phosphor yl at i ng act i vi t y t o t he C-57posi t on，i s of hi gh pot ent i al f or t he pr oduct i on of i nos i ne-5'-m onophosphat e due t o m i l d r eact i on condi t i ons．I n t hi s pa pe r，r ecom bi nant E c ol iB L21(D E3)／pE T28b-A P／PT w hi ch has e xpr e ss ed ac i d phos phat a se s w as use d，and t he ef fect s of cul t ur e condi t i ons o n ce l l gr ow t h and enzy m e act i vi t y w e r e i nves t i gat ed i n5L f e r m e nt er．T he opt i m al condi t i ons of cul t ur e w e r e as f ol l o w i ng：i ndu ct i on t i m e w as at O D c劬o=7，t he l act os e concent r a t i on w as of10g／L，vent i l at i on vol um e w as of1．5L／m i n．U nder t he cul t ur e condi t i ons，t he enzym e act i vi t y and O D600c oul d r ea ch221．4U几and20．4．r es pect i vel y．K ey w or ds：r ec om bi na nt E．col i；phosphot r ansf er ase；f er m ent at i on；opt i m i zi ng condi t i ons以57一肌苷酸(5'-I M P)为代表的呈味核苷酸，是新一代食品增鲜剂，常与5’一鸟苷酸(5’一G M P)按1：1混合而成。
重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化
重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化摘要:将重组大肠杆菌pC6-BL21活化后,用IPTG诱导表达,探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件｡结果表明,菌株在37 ℃,接种量为2%,摇瓶培养3.0 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃诱导5.0 h,收获的蛋白产量最高,经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白,Western blotting分析显示该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力｡关键词:重组人胶原蛋白肽;纯化;表达Optimization of Expression and Purification Procedure of Recombinant Human Collagen PeptideAbstract: To optimize the fermentation and purification conditions of recombinant human collagen peptide(CP6) in E. coli pC6-BL21, the temperature, opportunity and time for induction as well as inducer concentration for CP6 expression in recombinant E. coli was optimized. The optimal induction and expression conditions were as follows, after inoculating at an amount of 2%, the bacteria were fermented for 3.0 h at 37 ℃; then 0.5 mmol/L IPTG was added as inducer; and the peptide was expressed under 30 ℃for 5.0 h. After fermented under the optimal conditions, the lysate of bacteria was purified by nickel ion affinity; and purity of target protein was determined by SDS-PAGE. Results showed that pure protein could be obtained if eluted by 150 mmol/L imidazole buffer after being purified, and western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2.Key words: recombinant human collagen peptide; expression; purification胶原蛋白是一类广泛分布于动物结缔组织的蛋白质[1],对维护机体的正常生理功能和损伤修复有重要作用｡目前胶原蛋白的生产主要是用酸､碱水解法从动物结缔组织提取,提取过程中会或多或少地丧失胶原蛋白的生物活性,应用于人体时还可能会产生排异反应,且存在着极大的病毒隐患[2,3]｡鉴于胶原蛋白有广阔的应用前景,特别是医用材料､保健品领域迫切需要大量优质的胶原蛋白,寻找新的安全可靠的手段制备胶原蛋白十分重要,利用基因工程手段重组表达人胶原蛋白成为研究热点[4-6]｡本实验以LB培养基为基础,采用单因素实验对重组人胶原蛋白在大肠杆菌中诱导表达的一系列条件,如接种量､诱导时机､诱导物浓度､诱导温度和表达时间等进行了优化[7],并对所得的胶原蛋白进行了纯化和鉴定,为进一步研究发酵工艺提供了实验基础｡1材料与方法1.1材料和试剂实验菌种为重组大肠杆菌pC6-BL21(DE3),由吉林农业大学生物物理实验室构建并保存｡质粒提取试剂盒､胶回收试剂盒､IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)､蛋白胨(OXOID)､酵母提取物(Yeast extract,YE)均购自北京鼎国生物工程有限公司;Ni-NTA His·Bind树脂和Ni-NTA缓冲液试剂盒均购自MERCK公司,其他试剂和药品均为国产分析纯｡1.2表达条件的优化挑取一环-80 ℃､25%甘油保存的工程菌,接种于LB固体培养基中,37 ℃培养24 h,然后挑单菌落于100 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 r/min振荡培养过夜,以活化菌种｡活化后按不同接种量､诱导时机､诱导物IPTG浓度､诱导温度和表达时间设置单因素实验,诱导胶原蛋白的表达,单因素实验每个处理设置3个重复｡①接种量:设置1%､2%､3%､4%､5% 5个接种量水平,将活化的菌种接种到含有50 mL LB培养基的250 mL的三角烧瓶中,37 ℃､200 r/min振荡培养4.0 h至OD600为0.7时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;②诱导时机:将过夜活化的种子液按2%的接种量接种于50 mL LB培养基中,37 ℃,200 r/min分别培养1.0､1.5､2.0､2.5､3.0､3.5､4.0 h后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;③IPTG浓度:活化的菌种接种后在37 ℃培养2.5 h后加入IPTG至终浓度分别为0.1､0.3､0.5､0.7､1.0 mmol/L,分别诱导培养5.0 h;④诱导温度:按最佳接种量和最佳诱导物浓度,在不同的诱导温度下(28､30､33､37 ℃)诱导胶原蛋白的表达,确定最佳诱导温度;⑤表达时间:使用①~④所得的实验条件,分别在菌种诱导表达后2.0､3.0､4.0､5.0､6.0､7.0 h取样,以确定最佳表达时间长度｡1.3重组蛋白含量的测定①细胞密度测定:发酵液经稀释1~10倍后,用可见分光光度计在600 nm处测其光吸收值｡②重组蛋白含量的测定:工程菌发酵结束后,取50 mL经诱导的摇瓶培养发酵液,10 000 r/min离心1 min,用0.5 mL pH值为7.4､50 mmol/L的Tris-HCl 缓冲液洗涤沉淀,吸净上清液｡用1~5 μL的蒸馏水重悬菌体,并立即加入等量的2×SDS聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液,混匀后,沸水浴5 min｡吸取裂解后的样品液作聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色测定菌体总蛋白后,采用Bandscan软件扫描SDS-PAGE电泳图,分析出每条泳道重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量并计算出重组蛋白含量｡1.4表达产物的分离纯化菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NTA柱亲和层析,用10倍体积20 mmol/L Tris-HCl(含0.3 mol/L NaCl,pH 8.0)平衡柱体,然后分别用60､100､120､150 mmol/L 的咪唑缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱,收集各个洗脱峰,SDS-PAGE分析收集的成分｡1.5重组蛋白的Western blotting鉴定将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE,转印至醋酸纤维素膜上,然后将膜在含5%的PBS中室温封闭2.0 h,洗膜后加入小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,洗膜后再加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,充分漂洗后加入化学发光底物Super Signal检测试剂,暗室X光片暗匣曝光､显影｡2结果与分析2.1接种量的优化从图1可以看出,菌体的生物量随着接种量的增加而提高,而重组蛋白产量在接种量为2%时最高,继续增大接种量,其产量反而下降｡这可能是由于接种量增加导致菌体生长过快过稠,造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵产蛋白[8]｡考虑到在大规模发酵过程中,接种量过小会导致菌体增殖缓慢,而接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用,确定2%为最佳接种量｡2.2IPTG诱导时机的优化诱导时机对目的蛋白表达效果的影响比较大(图2),培养3.0 h后,即对数生长中后期再添加诱导剂,蛋白的表达量最高｡过早添加诱导剂会抑制菌体的增殖,导致生物量减少,在培养时间内获得的表达量也就低;过晚添加诱导剂,菌体已处于生长稳定期,培养基内营养成分减少,细胞代谢速度减缓,合成蛋白的能力降低,表达量也会减少｡因此选择在对数生长中后期即培养3.0 h后加入诱导剂｡2.3IPTG诱导浓度的优化如图3所示,不同浓度的IPTG对外源蛋白的表达有一定的影响｡低浓度条件下,随着IPTG的浓度增加,外源蛋白的表达量也增加,在IPTG浓度为0.5 mmol/L时达到最大值,此后随着IPTG浓度的增加表达量反而下降｡由于高浓度的IPTG会对菌体生长造成毒害作用,同时为了节约成本,选择0.5 mmol/L为最适诱导浓度｡2.4诱导温度的优化过低或过高的温度都会使菌体代谢缓慢,不利于外源基因的表达[9]｡实验结果(图4)表明,随着温度升高,收获的菌体生物量先升后降,在30 ℃时菌体生物量最高｡而重组蛋白的表达随着温度的升高而加强,在37 ℃时最高,因此选择37 ℃为最佳诱导温度｡2.5表达时间的优化如图5所示,诱导5.0 h时蛋白表达量和生物量均达到最大值｡继续诱导,生物量和表达量均下降｡收集时间过早,蛋白的表达还不充分,收集时间过迟则可能导致细胞老化,自溶,发酵液中杂蛋白多,不利于纯化,综合考虑确定最佳诱导时间为5.0 h｡2.6目的蛋白的分离纯化大量诱导表达融合蛋白,经超声破碎､离心后,收集上清液,经Ni-NTA柱亲和层析提纯重组蛋白,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白｡SDS-PAGE检测见图6,重组蛋白相对分子质量约为46 ku,与预期相符｡2.7重组蛋白的Western blotting鉴定Western blotting(图7)分析显示,1号泳道空白对照无特异性反应条带,而2号泳道中纯化产物与小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体有特异性反应｡3结论本实验研究了不同的培养条件对重组蛋白表达的影响,结果表明接种量对重组蛋白表达影响较大,当接种量过大时,会直接影响菌体生长状态,从而抑制重组蛋白的表达;ITPG有毒性,培养基中IPTG浓度过低会使诱导力度不够,蛋白表达少,过高则可能会影响菌体生长;诱导时机和诱导后的培养时间都对目的蛋白的产量有重要的影响｡确定了重组蛋白表达的最佳培养条件:接种量为2%,培养3.0 h后添加终浓度为0.5 mmol/L的ITPG,37 ℃下诱导表达5.0 h,表达的重组蛋白含量最高｡本研究使用重组质粒pET22b-CP6转化的大肠杆菌pC6-BL21(DE3),经IPTG 诱导表达,得到可溶性重组蛋白,经Ni-NTA柱亲和层析纯化获得重组蛋白,方法简单易行｡本实验的结果为进一步在发酵罐内进行分批发酵和补料发酵提供了参考｡参考文献:[1] 蒋挺大,张春萍. 胶原蛋白[M]. 北京:化学工业出版社,2001.[2] TOMITA M, MUNETSUNA H, SATO T, et al. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons[J]. Nat Biotechnol,2002,21(1):52-56.[3] RUGGIERO F, EXPOSITO J Y, BOURNAT P, et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants[J]. FEBs Letters,2000,469(1): 132-136.[4] 杨立霞,修建新,朱欣杰,等. 重组生产胶原蛋白的研究进展[J]. 河北化工,2007,30(007):43-46.[5] LUO Y E,FAN D D,MA X X,et al. Process control for production of human-like collagen in fed-batch Escherichia coli BL21[J]. Chin J Chem Eng,2005,13(2):276-279.[6] 范代娣. 一种类人胶原蛋白及其生产方法[P]. 中国专利:ZL01 1067578,2005-04-13.[7] 沈宝明,谭新球,谭周进,等. 影响工程菌株目的基因表达的因素[J]. 生物技术通报,2010(3):6-12.[8] 戎晶晶,刁振宇,周国华. 大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术,2005,12(6):416-420.[9] MICHAEL J W, MARIA P, SHAWNR R C, et al. Stabilization of apoglobin by low temperature increases yield of soluble recombinant hemoglobin in Escherichia coli[J]. Applied and Environment Microbiology, 1997,63(11):4313-4320.。
重组胶原蛋白技术___概述说明以及解释
重组胶原蛋白技术概述说明以及解释1. 引言1.1 概述胶原蛋白是人体最丰富的一种结缔组织蛋白质，广泛存在于皮肤、骨骼、血管等人体组织中。
它具有良好的生物相容性和生物降解性，因此在医学领域有着广泛的应用前景。
然而，传统从动物源提取胶原蛋白存在许多限制，如可能引发传染病、负担过重、批量不稳定等问题。
为了克服这些问题，重组胶原蛋白技术应运而生。
1.2 文章结构本文将首先对重组胶原蛋白技术进行概述，并介绍胶原蛋白的定义和作用以及重组胶原蛋白的基本原理。
接下来，文章将详细解释重组胶原蛋白技术的关键步骤和方法，包括基因工程方法在制备中的应用、细胞培养和表达系统选择与优化以及制备和纯化重组胶原蛋白的常用技术手段与策略。
然后，文章会探讨重组胶原蛋白技术的前景与挑战，展望未来的应用前景，并分析面临的挑战与问题。
最后，文章总结主要观点并对未来研究进行展望，强调重组胶原蛋白技术的意义和价值。
1.3 目的本文旨在全面介绍重组胶原蛋白技术，包括其概述、关键步骤和方法以及应用前景与挑战。
通过对该技术的深入了解和解释，旨在促进人们对于重组胶原蛋白技术的认识和理解，并进一步推动该领域的研究和发展。
2. 重组胶原蛋白技术概述2.1 胶原蛋白的定义和作用胶原蛋白是一种结构性的蛋白质，在人体中广泛存在于皮肤、骨骼、血管、肌肉和关节之中。
它具有提供支撑、保持组织稳定性以及促进细胞黏附和迁移等生物学功能。
胶原蛋白由三个α链拧成左旋螺旋状，并形成纤维状结构，因其良好的生物相容性和生物可降解性而被广泛应用于医学领域。
2.2 重组胶原蛋白的基本原理重组胶原蛋白技术是利用基因工程方法将人工合成的DNA序列导入到表达系统中，以产生与自然胶原蛋白相似或类似的蛋白质。
通常，选择适当的宿主细胞表达系统，将目标DNA序列插入到该细胞中，并通过控制环境条件来促使该细胞大量产生目标重组蛋白。
最后，采用适当的纯化技术手段，可获得高纯度的重组胶原蛋白。
2.3 重组胶原蛋白技术的应用领域重组胶原蛋白技术在医学、生物工程和材料科学等领域具有广泛的应用前景。
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化
重组人表皮生长因子融合蛋白是一种常用的生物制药品，可以促进伤口愈合和组织再生。
它通常是通过大肠杆菌的重组表达系统生产的，生产过程中需要进行发酵条件的优化。
发酵条件的优化包括培养基成分、初始pH值、温度、转速、氧气供应等多个因素。
其中，培养基成分是最重要的因素之一，常用的培养基成分包括碳源、氮源、矿物质和缓冲剂等。
通过对这些成分的不同比例和浓度的优化，可以提高蛋白表达的产量和纯度。
另外，初始pH值的调节也是发酵条件优化的关键因素之一。
pH值对菌体的生长和代谢活动有着重要的影响，因此需要在合适的pH范围内进行调节。
通常，pH值的最佳范围为7.0-7.5。
温度和转速也是影响重组人表皮生长因子融合蛋白发酵的重要因素。
温度的调节需要根据菌株的生长特性进行，一般在30-37℃之间。
转速则需要根据发酵容器的尺寸和形状进行调节，通常转速范围为150-250 rpm。
最后，氧气供应也是影响蛋白产量的关键因素之一。
氧气供应不足会导致菌体代谢活动受阻，从而影响蛋白表达的产量和纯度。
因此，需要根据容器的形状和体积进行合理的氧气供应。
总之，重组人表皮生长因子融合蛋白的发酵条件优化对于提高蛋白的产量和纯度至关重要，需要综合考虑多个因素进行优化。
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化重组人表皮生长因子融合蛋白（rhEGF）是一种重要的生物制剂，在生物医药领域具有广阔的应用前景。
为了提高rhEGF的生产效率和经济性，发酵条件优化是至关重要的。
本文将从发酵菌株选择、发酵培养基成分和发酵工艺参数三个方面进行讨论。
1. 发酵菌株选择发酵菌株的选择是影响rhEGF生产的关键因素之一。
常用的菌株包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。
其中，大肠杆菌是最常用的菌株，其在培养基制备、生长速率和生产成本方面具有优势。
而哺乳动物细胞能够更好地保持rhEGF的天然构象，但其在培养基制备、筛选和转染过程中的成本较高。
2. 发酵培养基成分发酵培养基是指提供菌体生长和代谢所需的营养物质的培养基。
发酵培养基成分的优化对于提高rhEGF的生产量和质量具有重要影响。
一般来说，发酵培养基需要包含碳源、氮源和无机盐等基本成分。
对于大肠杆菌菌株，常用的碳源有葡萄糖、甘露醇等，氮源有酵母膏、氨基酸等。
此外，添加适量的辅助物质如维生素、胺类化合物等也能提高rhEGF的产量和质量。
3. 发酵工艺参数发酵工艺参数的优化是实现高产rhEGF的关键。
常用的工艺参数包括发酵温度、pH值、初始接种量、接种时间和氧气传质等。
发酵温度是一个重要的参数，过高或过低的温度都会对菌体生长和rhEGF表达产生不利影响。
一般来说，大肠杆菌的最适生长温度为37°C。
pH值也对发酵产物的产量和酶活性有重要影响，一般调节在6.5~7.5之间。
初始接种量和接种时间的选择应结合菌株和发酵容器的大小进行调整，以保证发酵过程中的合理生理状态。
此外，控制好氧气传质是提高rhEGF 产量的重要手段之一，可以通过调节搅拌速度、增加曝气量等方式实现。
综上所述，通过优化发酵菌株的选择、发酵培养基成分的调整以及发酵工艺参数的优化，可以有效提高rhEGF的生产效率和经济性。
这将为rhEGF的工业化生产提供可靠的技术支持，也为人们提供更多的治疗选择和保健产品。
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化重组人表皮生长因子（rhEGF）是一种重要的蛋白质药物，可用于治疗各种疾病，如烧伤、创伤和溃疡。
生产rhEGF的最常用方法是通过发酵技术。
优化发酵条件可以提高生产效率和蛋白质产量，从而降低生产成本并保证产品质量。
发酵条件优化包括生长培养基配方、发酵温度、pH值、发酵时间等因素。
下面将重点介绍这些因素在rhEGF的发酵条件优化中的作用。
生长培养基配方生长培养基配方是发酵过程中最基本的因素之一。
正确的培养基配方是提高生产效率和蛋白质产量的关键。
常用的基础培养基组分包括碳源、氮源、矿物质盐、维生素和其他营养物质。
对于rhEGF的生产，最常用的培养基是含有蔗糖和酵母提取物的酵母营养液（YNB）培养基。
其他常见的培养基包括蛋白胨蔗糖培养基、大豆蛋白蔗糖培养基等。
此外，可以通过添加缓冲剂、生物素、硫氮源和其它有机或无机物质来优化培养基组分。
发酵温度发酵温度是控制细菌生长速率、代谢和生成目标产物的一个重要因素。
针对rhEGF的发酵生产过程，适宜的发酵温度一般在30°-35℃之间。
温度过高或过低都会影响细胞的生长和合成酶的活性。
此外，温度的适宜范围还会根据不同的生产菌株而有所变化。
pH值pH值对于发酵的成功与否同样非常重要。
发酵过程中，必须保持恰当的pH值，以确保优良的细菌生长环境，来保持产物的表达和积累。
对于rhEGF的发酵，一般的pH值范围为6.5-7.5之间。
过高或过低的pH值都会导致Cell的代谢酶活性受到影响。
因此，必须在发酵过程中监测pH值来调控酸碱平衡。
发酵时间在确定合适的生长培养基和上述条件的前提下，另一个重要的考虑是发酵的时间。
发酵时间是影响rhEGF表达和积累的关键因素。
发酵过程中，必须严格掌握最佳的发酵时间，以使产物表达和积累的量最大。
对于rhEGF的发酵，一般发酵时间为24-48小时。
过短的发酵时间不能充分发挥细胞培养的效率，产生的产品较少，过长的发酵时间可能会导致表达不稳定或产物的降解。
重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化
重组人表皮生长因子融合蛋白（recombinant human epidermal growth factor fusion protein，rhEGF-FP）是一种重要的生物制药产品，广泛应用于创伤愈合、创伤修复、角膜组织修复等领域。
为了获得高产量和优质的 rhEGF-FP，需要优化发酵条件。
本文将从培养基、发酵条件和产物提取等方面，探讨rhEGF-FP的发酵条件优化参考内容。
一、培养基的优化选择合适的培养基是优化发酵条件的重要一步。
常用的基本培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、维生素和生长因子等。
例如，可以选用碳源为葡萄糖，氮源为酵母粉或酵母提取物，无机盐为磷酸盐、硫酸铵等，维生素为硝酸盐，生长因子为酵母提取物或氨基酸等。
此外，可以通过正交试验等方法优化培养基的组成，寻找最佳的培养基配方。
二、发酵条件的优化 1. pH 值的优化：pH 值对于菌体的生长和产物的表达具有重要影响。
常用的发酵 pH 值范围为 6.0-7.5。
可以通过对不同 pH 值下的菌体生长和产物表达情况的检测，确定最佳的发酵 pH 值。
2.温度的优化：温度的选择对于菌体的生长和产物的溶解和稳定性有重要影响。
通常发酵温度范围为 20-37°C。
可以通过对不同温度下的菌体生长和产物表达情况的检测，确定最佳的发酵温度。
3.氧气传递和搅拌条件的优化：氧气传递和搅拌条件对于微生物的生理代谢和产物的表达具有重要影响。
可以通过调节搅拌速度、改变搅拌方式（例如改用机械搅拌或气体升降式搅拌）等手段，优化氧气传递和搅拌条件。
三、产物提取条件的优化产物提取是重组蛋白生产的最后一步，直接影响产物的纯度和活性。
常用的产物提取方法包括机械破碎法、超声波法、冷冻-融化法、酶解法等。
可以通过比较不同提取方法的效果，选择最佳的产物提取条件。
四、关键指标检测方法的建立对于优化发酵条件，需要建立适用于 rhEGF-FP 的关键指标检测方法，包括菌体生长曲线的检测方法、产物表达量的定量方法、产物纯度的分析方法等。
重组胶原蛋白发酵水平
重组胶原蛋白发酵水平
重组胶原蛋白的发酵水平是指在发酵过程中获取的重组胶原蛋白的产量和纯度。
重组胶原蛋白是通过将人工合成的胶原蛋白基因导入到宿主细胞中，然后利用发酵技术使宿主细胞产生大量的重组胶原蛋白。
在进行重组胶原蛋白的发酵时，可以优化培养基成分、发酵条件和发酵时间等因素来提高其发酵水平。
以下是提高重组胶原蛋白发酵水平的一些方法：
1. 优化培养基成分：通过调整碳源、氮源、矿物质和生长因子等培养基成分，提供充足的营养物质以促进细胞的生长和蛋白质的产生。
2. 优化发酵条件：包括控制温度、pH值、氧气供应、搅拌速度等参数，以在最适合的条件下使细胞达到最高的生长速率和最大的蛋白质产量。
3. 应用遗传工程技术：通过引入外源基因或调控内源基因的表达水平，可以增强细胞对重组胶原蛋白的产生能力。
4. 优化发酵时间：在发酵过程中控制合适的时间，以确保蛋白质的产量达到最大化，并避免蛋白质的降解。
通过以上方法的综合应用，可以显著提高重组胶原蛋白的发酵水平，从而获得更高产量和更高纯度的重组胶原蛋白。
一种类人胶原蛋白及其生产方法
一种类人胶原蛋白及其生产方法
胶原蛋白是一种重要的蛋白质，它在人体中起着支撑和保护组织的作用。
而类人胶原蛋白是一种类似于人体内所产生的胶原蛋白的合成蛋白质。
本文将介绍一种类人胶原蛋白及其生产方法的相关信息。
类人胶原蛋白是通过基因工程技术来合成的人造蛋白质。
首先，研究人员从人体中提取了胶原蛋白相关的基因序列。
然后，利用基因工程技术将这些基因序列插入到微生物（如大肠杆菌）的染色体中。
接着，通过培养这些经过基因改造的微生物，可以用它们来生产类人胶原蛋白。
这种类人胶原蛋白的生产方法具有以下几个优点。
首先，利用基因工程技术可以很精确地改造微生物的基因，从而实现对类人胶原蛋白的合成。
其次，与传统的胶原蛋白提取方法相比，类人胶原蛋白的生产更加高效、纯度更高。
此外，类人胶原蛋白的生产过程可控性强，可以根据需要进行扩大规模生产。
类人胶原蛋白在医学和生物科技领域有着广泛的应用。
它可以被用作组织工程中的材料，用于修复和重建受损的组织。
此外，类人胶原蛋白还可以用于制造生物医用材料，例如人工血管和人工关节等。
由于类人胶原蛋白与人体内产生的胶原蛋白非常相似，它具有良好的生物相容性，能够有效地减少组织排斥反应。
总之，类人胶原蛋白是一种通过基因工程技术生产的合成蛋白质。
它在医学和生物科技领域具有广泛的应用潜力，可以被用于组织工程和生物医用材料的制造。
通过类人胶原蛋白的研究和生产，我们可以更好地满足人类对于组织修复和替代的需求，促进医学的进步和发展。
响应面法优化以重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白过程_英文_
1 INTRODUCTION
Collagen is a kind of fibrous protein providing structural support for cells, tissues and organs. It has great tensile strength, and is the main component of fascia, cartilage, ligaments, tendons, bone and skin [1-3]. All types of collagen molecules have common triple helical domain, in which each of the three α-helices contains the repeating sequences Gly-X-Y, where X and Y are frequently proline and hydroxyproline residues respectively [3-6]. Human-like collagen is an intracellular macromolecular protein with high biological activity, and its gene coding is expressed by recombinant E. coli with a modified cDNA fragment transcribed from the mRNA coding for human collagen. Human-like collagen is of a tri-helix structure, similar to the collagen type I with the tri-helix structure consisting of one α1 and two α2 chains, and comprises three same modified chains. It has a low immunogenicity compared with that isolated from animal tissues by conventional extraction methods and is free of viruses and prions [7]. Human-like collagen III in this study is a new type collagen, which has not been studied and reported. The investigation of its fermentation process may provide a method for the production of HLC III.
基因重组大肠杆菌表达类人胶原蛋白诱导条件优化研究
基因重组大肠杆菌表达类人胶原蛋白诱导条件优化研究马晓轩;范代娣;骆艳娥;米钰【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2005(25)4【摘要】为了提高重组大肠杆菌BL 21高密度发酵生产类人胶原蛋白的产量,分别研究了诱导时机、乙酸浓度、诱导强度以及补氮方式对外源基因表达的影响,并对各因素进行了优化。
采用补料-分批式发酵,初始装液体积为6L。
最终细胞密度可达到84.3g／L,类人胶原蛋白的表达量为 14.6g/L。
结果表明:在对数生长的中后期进行诱导,尽量减少乙酸的积累量,42℃诱导3h后降温至39℃继续诱导,并采用每隔10min补36ml补料氮溶液的周期操作方式,有利于细胞的生长和外源蛋白的表达。
【总页数】4页(P29-32)【关键词】类人胶原蛋白;大肠杆菌表达;优化研究;诱导条件;基因重组;重组大肠杆菌;外源基因表达;发酵生产;细胞密度;外源蛋白;操作方式;高密度;酸浓度;表达量;中后期;积累量;补料;生长【作者】马晓轩;范代娣;骆艳娥;米钰【作者单位】西北大学化工学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;TQ929【相关文献】1.基因重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白补氮策略优化研究 [J], 张兮;范代娣;花秀夫;骆艳娥;马晓轩2.基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化 [J], 谢秋玲;陈小佳;朱伟杰;赵振云;吴建虹;徐万祥;刘侃;李菁3.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ条件优化 [J], 常海燕;范代娣;骆艳娥;马晓轩;米钰;朱晨辉;迟雷4.基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化 [J], 梅建凤;赵文渊;易喻;陈建澍;张彦璐;应国清5.Ⅲ型类人胶原蛋白在大肠杆菌重组表达及发酵制备 [J], 李瑛琦;垄劲松;许正宏;史劲松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第5期
王维卓等: 重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白 !的发酵 pH 优化
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to g ain higher co ncent ration of H CL ! w hich reached t o 11 3 g /L , increased by 7 61% as com pared w it h const ant pH ferment at ion. Key words: H uman like col lag en !; recombinant escherichia coli; pH shif t cont ro l; o rganic acid
收稿日期: 2009 12 11 基金项目: 国家 863 计划基金资助项目( 2006A A 02Z246; 2007AA 03Z456) ; 国家自然 科学基金资助项目( 20776119) ; 陕西
省教育厅科学研究发展计划基 金资助项目( 07JK417) 作者简介: 王维卓, 男, 硕士研究生, 主要研究方向为发酵过程优化. * 通信作者: 范代娣, 女, 教授, 博士研究生导师. E mail: fandaidi@ nwu. edu. cn.
郭佳庆1, 2
摘 要: 为了实现类人胶原蛋白( H L C !) 的规模化生产, 对重组大肠杆菌 BL 21 3 7 在 30 L 发酵 罐中发酵生产类人胶原蛋白 !过程中的关键参数 pH 进行了系统的研究. 将发酵过程中 pH 控制 在 6 0~ 7 8 之间, 监测 pH 对细胞生长以及类人胶原蛋白 !的产量的影响, 从而确定出合理的 pH 控制策略增加类人胶原蛋白 !的产量. 由实验数据可得, 在 pH 7 5 条件下细胞浓度达到最大, 为 68 5 g/ L, 但 H CL !的浓度为 8 5 g/ L . 在 pH 6 8 条件下, H LC !浓度达到最大, 为 10 5 g / L , 但 其细胞浓度只有 60 9 g/ L. 同时, 对发酵过程中代谢副产物有机酸的含量也进行了监测, 随着发酵 过程 pH 值的升高, 总有机酸的量也相应的增加, 当发酵过程 pH 控制在 7 8 时, 总有机酸达到最 大, 为 15 61 g/ L . 为了提高目标产物的产量, 采用 pH 两阶段控制策略控制发酵, 最终类人胶原蛋 白 !浓度可达到 11 3 g/ L, 较恒 pH 条件下提高了 7 61% . 关键词: 类人胶原蛋白 !; 重组大肠杆菌; pH 两阶段控制; 有机酸 中图分类号: Q815 文献标志码: A
第 38 卷 第 5 期
陕西师范大学学报( 自然科学版)
2010 年 9 月 Journal of Shaanx i Norm al U niversit y ( Nat ur al Science Edit ion)
Vol. 38 N o. 5 Sep. 2010
文章编号: 1672 4291( 2010) 05 0072 05
因此, 我们较为系统地研究了 pH 值对重组大 肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白过程中细胞的生长代 谢以及产物形成的影响, 以优化发酵工艺条件, 提高 生产效率.
1 实验材料及方法
1 1 菌种与培养基 基因工程菌 E. col i BL 21 3 7, 卡那抗性, 温度
诱导, 质粒 pN WCP31, 由本实验室构建并保存[ 11] .
M gSO 4 EDT A 微量元素 卡那霉素 消泡剂
87 42 55 25
1 06 0 005 01
26 12 6 16 5 20
3 3 0 005
1 2 发酵罐 瑞士 Bioengineering 公司 D1283 自动控制发酵
罐( 30L ) , 可在 线检测温度、搅拌速度、溶解氧浓度 ( DO) 、pH 值等过程参数. 1 3 培养方法 1 3 1 种子培养 从 L B 平板上刮取两个单菌落, 分别置于两个盛有 80 m L 种子培养基的 300 mL 摇 瓶中, 温度 34 ∃ , 转速 220 r /min 的条件下摇床培养 10~ 12 h, 获得一级种子. 然后转接至 8 个盛有 80 m L 种子培养基的 300 mL 摇瓶中, 相同条件下摇床 培养 10~ 12 h, 制备二级种子. 1 3 2 分批 补料培养 将培养好的种子接种至装 有 10 L 发 酵培养 基的 30 L 发酵 罐中, 控制 温度 34 ∃ . 在分批 补料培养阶段, 通过调节空气流量、提 高搅拌转速和罐压将细胞密度( DO) 控制在 20% ~ 30% 空气饱和度, 用 25% 氨水和 2 mol /L H 2SO4 自 动调节 pH . 当发酵罐中的葡萄糖耗尽时, 采用溶氧 反馈补料方式进行发酵. 当细胞密度( OD) 达到 90 ~ 100 时, 升 温 至 42 ∃ 开 始 诱导, 3 h 后 降温 至
种子培养基: 液体 L B 培养基. 分批发酵培养基 和补料培养基如表 1 所示.
表 1 培养基的组成 Tab. 1 Medium composition
成分
分批发酵培养基 / ( g # L- 1 )
补料培养基 / ( g# L- 1)
葡萄糖
40
酵母粉
50
1 000 40 0
Байду номын сангаас
K2 H PO 4 N aH 2 PO 4 ( N H4) 2 SO4
胶原蛋白又称胶原, 是动物体内含量最丰富的 结构蛋白. 胶原蛋白起 着支撑器官、保护机体 的作 用, 从而广泛应用于医药、材料、美容保健、食品、化 工等行业[ 1] . 然而, 来源于动物组织的胶原蛋白存在 疾病传染等问题, 限制了异种和异体胶原在人体中 的应用, 从而使得改性胶原备受关注[ 2] .
L B 培 养 基: 蛋白 胨 10 g /L; 酵 母粉 5 g /L; NaCl 10 g /L ; 琼脂 20 g /L .
卡那霉素( Kanam ycin, Kan) 抗性培养基: 蛋白 胨 10 g /L ; 酵 母粉 5 g /L; NaCl 10 g /L , Kan, 0 5 m g /m L.
重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白 !的发酵 pH 优化
王维卓1, 2 ,
范代娣1, 2, 3* , 骆艳娥1, 2, 3 , 马晓轩1, 2, 3 , 朱晨辉1, 2, 3 ,
( 1 西北大学 化工学院; 2 陕西省生物材料与发酵工程 技术研究中心; 3 陕西省可降解生物医用材料重 点实验室, 陕西 西安 710069)
Optimal Strategy of pH Control in the Production of HLC! by Recombinant Escherichia coli
WA N G Wei zhuo1, 2 , FA N Dai di1, 2, 3* , LU O Y an e1, 2, 3 , MA Xiao xuan1, 2, 3 , ZH U Chen hui1, 2, 3 , GU O Jia qing1, 2 ( 1 College of Chemical Engineering , N ort hw est Universit y; 2 Shaanx i R& D Center of Bio materials and F er mant at io n Eng eering; 3 Shaanx i Key Laborat ory of Deg radable Biomedical M aterials, Xi∀an 710069, Shaanx i, China) Abstract: T o achieve large scale pro duct ion of H L C !, t he key paramet er pH in pr oduct ion pro cess of human like collagen by recom binant Escher ichi a col i BL 21 3 7 w as syst em at icly invest igat ed in a 30 L f erm ent ation t ank w it h triplex t ur bine impeller. T he ef fect of pH rang ing fro m 6 0 to 7 8 on cell content and H LC ! production dur ing fermentat ion pr ocess w as st udied, and an opt imal pH strat egy w as det er mined f or increase of H LC ! yield. F rom experiment al dat a, t he cell g row t h and co llag en synt hesis w er e significant ly af fect ed by pH . A n o pt imal pH of 7 5 fo r cell g row t h w as obt ained w it h cell densit y at 68 5 g /L , t he concent ration of H L C ! w as 8 5 g /L; w hile an opt imal pH of 6 8 f or H L C ! accumulat io n w as obt ained w it h concentr at ion of H L C ! at 10 5 g /L, and cell densit y w as 60 9 g /L. A ddit ionally, t he t ot al org anic acid of fermentat ion process w as monit ored. T he concent rat ion of or ganic acid incr eased w it h pH , and the highest concent rat ion of o rganic acid, 15 61 g /L , w as observed w hen pH w as kept const ant at 7 8 during t he process o f f er ment at io n. Based o n t he r esult s, a pH shif t method w as developed