环境中微生物的地检测和分离纯化

环境中微生物的检测和分离纯化

姓名：王韬

班级：生76

组号：7-2组

同组人：袁堂谧

实验日期：2009-11-12

一、实验目的：

1.熟悉常用微生物培养基配置方法。

2.联系无菌操作技术。

3.学习单菌落划线分离法。

4.通过实验认识环境中微生物的分布。

二、实验原理：

1.微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的

过程称微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧的条件要求不同，而供给他们适宜

的培养条件，或加入某些抑制剂造成一支其他菌生长而利于此菌生长的环境。

2.平板菌落计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分

分散成单个细菌，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长

繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞。该计数法

最大的优点是可以获得活菌的信息。

三、实验材料：

土壤悬液（稀释100倍），未知菌菌落平板，无菌水，取液器，培养箱，培养皿，无菌涂棒，接种环，接种针，酒精灯。

四、实验步骤：

(一)培养基的制备（提前准备）：

肉汤蛋白胨培养基：

牛肉膏 2g

蛋白胨 4g

NaCl 2g

蒸馏水 400mL

琼脂 8g

1.称量：按上述配方称量各类物质。

2.溶解：在400mL水中溶解牛肉膏、蛋白胨和NaCl，混合加热溶解。

3.调pH值：调至7.2-7.4

4.过滤（本实验无需过滤）

5.加凝固剂：加入称量好的琼脂，混合均匀。

6.分装

7.包扎和灭菌

8.倒平板

(二)从土壤中分离微生物

1.采土样（已事先准备）：选择较肥沃的土壤，铲去表层土，挖5-20cm深度的或

特殊要求的土壤数十克，装入已灭菌的牛皮纸袋，封好袋口，做好编号记录。

2.制备土壤稀释液（已事先稀释至100倍）：称取1.0g，放入盛99mL无菌水并

带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土壤均匀分散成土壤悬液（10-2）。

3.继续稀释土壤悬液至合适浓度：用无菌吸头从上述稀释液中吸取0.1mL土壤悬

液，注入事先装有0.9mL无菌水的Ep管中，用同样的方法，分别配置浓度为

10-3，10-4，10-5的土壤溶液。

4.涂布：用一只新的无菌吸头，分别吸取各浓度的土壤悬液均匀地注入装有培养

基的平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度3个板。

5.培养：将平板倒置与37℃温箱中培养24h，统计所长出的菌落数。

6.菌落计数

(三)周围环境中微生物的检测

1.取一个平板，分成5区。做好标记（下同），分别用未洗过的、用自来水沾湿、

用自来水清洗过、用肥皂清洗过和用酒精棉球擦过的手指在对应的区上轻轻涂

抹（用力一致）。

2.取一个平板，分区，对应放入或涂上头发、牙垢、纸币和玩具。

3.取一个平板，置于酒精灯火焰边1min.

4.取一个平板，置于试验台空气中11min。

5.取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽。

6.取一个平板，分区，分别用河水，饮用水涂布。

7.取一个平板，用培养基轻沾一下嘴唇。

(四)单菌落划线分离

取一个平板，分区，用接种环取未知菌种，在平板上划线。划完一边后，灼烧接种

环，冷却后从上次划线的末端朝另一个方向划线。以此类推，划完各个方向。五、实验结果：

1.

板号浓度10-3 10-4 10-5

1 315 70 无法计数

2 338 无法计数无法计数

3 无法计数无法计数无法计数

表1. 土壤微生物平板计数结果

按照数据选取原则，应选择浓度为10-4板的结果。由计算公式

得：

土壤中的细菌含量（个/g土壤）=70/(0.1*10-4)=7×106

2.周围环境中微生物的检测结果说明（照片见后附录，图12-图18）：

1)分别用未洗过的、用自来水沾湿、用自来水清洗过、用肥皂清洗过和用酒

精棉球擦过的手指实验中，细菌最多的是用自来水沾湿的手指，用自来水

清洗过的、用肥皂清洗过的、未清洗过的手指的细菌量依次递减，用酒精

清洗过的手指没有细菌生长。

2)酒精灯火焰边放置1min的培养皿出现2个菌落，在空气中放置11min的培

养皿出现10个菌落。

3)头发，牙垢，玩具，咳嗽和嘴唇都有细菌。纸币未发现细菌。

4)河水和饮用水

3.单菌落划线分离（照片见后附录,图10-图11）：

六、实验结果讨论：

1.土壤微生物分离实验中，3个浓度的9个板中，只有10-3的两个板和10-4的一个

板的菌落可以计数。另外几个板无法计数的主要原因是细菌没有涂开，而产生

了菌苔，或者因为菌落太过密集而无法区分。可以改进操作，在滴加细胞悬液

时就应该分散滴加。滴加完应该涂布较长时间。涂布时最好按照一定的方向，

不要随意乱涂。土壤中细菌数的数量级在106个/g。另外，从菌落的形态分析，

可以看出，土壤中存在多种细菌。可见多种细菌广泛分布于土壤中。在分离过

程中，有两个因素可能造成较大误差。一是土壤悬液的稀释，进行下一级稀释

时应将本级稀释液充分混匀。二是涂布时可能引入杂菌，涂布时两个细胞重叠

也会造成计数时的误差。

2.我认为无菌操作中应注意以下几点：

1)始终在酒精灯火焰旁操作。

2)始终用无菌材料与样品直接接触。

3)尽量避免物品之间的接触，包括无菌器件与无菌器件的接触。

4)清楚细菌的来源，在实验过程中应随时避免。例如培养皿开口应尽量小，

时间尽量短。开口应对准火焰，而不要朝向人或其它细菌可能来源方向。

手或者其他器件不要出现在培养皿开口前方。

3.从周围环境中微生物的检测结果中可以看出，我们的周围环境，平时接触的各

种物品，人体自身都存在大量细菌。所以应注意平时卫生。例如，要饭前洗手，

饭后漱口。但是，也有些看似卫生的习惯是不科学的。例如，在手指实验中，

用自来水洗过的手指和自来水沾湿过的手指的细菌含量都是很大的。主要原因

是干手指的细菌不易脱落。纸币的实验也可以说明这点。废旧的纸币在培养基

上擦了两次，但没有任何细菌。肥皂洗过的手指细菌含量较少。而用酒精擦过

的手指没有任何细菌生长。这说明，洗手时，应该用肥皂等清洗干净，否则还

不如不洗手。实验结果表明，对于有“洁癖”的人来说，除非用酒精灯消毒液

经常擦拭物品，否则，不可能达到清除所有细菌的目的。人身体上就存在大量

细菌，例如我们的嘴唇，我们呼吸的气体等等。

4.单菌落划线实验中，我操作失误，所以没有得到预期结果。划每个方向时我都

重新接种了新菌落。所以没能得到单菌落。

七、参考文献：

陈金春，陈国强，微生物学实验指导，清华大学出版社，2005

八、思考题：

见实验讨论。

九、附录：