一步一步教你做转录组分析(HISAT, StringTie and Ballgown)

一步一步教你做转录组分析（HISAT, StringTie and

Ballgown）

该分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols 上的一篇名为Transcript-level expression analysis of

RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 的文章撰写的，主要用到以下三个软件：HISAT

(/software/hisat/index.shtml)利用大量FM 索引，以覆盖整个基因组，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对，相较于STAR、Tophat，该软件比对速度快，占用内存少。

StringTie(/software/stringtie/)能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比，StringTie实现了更完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平。Ballgown (https:///alyssafrazee/ballgown)是R语言中基因差异表达分析的工具，能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。然而Ballgown并没有不能很好地检测差异外显子，而DEXseq、rMATS和MISO可以很好解决该问题。

一、数据下载Linux系统下常用的下载工具是wget，但该工具是单线程下载，当使用它下载较大数据时比较慢，所以选

择axel，终端中输入安装命令：$sudo yum install axel然后提示输入密码获得root权限后即可自动安装，安装完成后，输入命令axel，终端会显示如下内容，表示安装成功。Axel工具常用参数有：axel ［选项］［下载目录］［下载地址］-s ：指定每秒下载最大比特数-n：指定同时打开的线程数-o：指定本地输出文件-S：搜索镜像并从X servers服务器下载-N：不使用代理服务器-v：打印更多状态信息-a：打印进度信息-h：该版本命令帮助-V：查看版本信息号#Axel 安装成功后在终端中输入命令：$axel

ftp:///pub/RNAseq_protocol/chrX_data.tar.g z此时在终端中会显示如下图信息，如果不想该信息刷屏，添加参数q，采用静默模式即可。

#数据下载后，进行解压：$tar–zxvfchrX_data.tar.gz解压后利用tree命令查看数据结构，它会以树状图的形式列出目录的内容。整个数据的结构如下图所示：

chrX_gtf是X号染色体的注释文件chrX.fa是X号染色体的序列文件indexes文件夹中是HISAT对于X号染色体的index文件，该文件是根据序列文件chrX.fa利用hisat2-build 构建的，samples文件夹中的12个fastq文件是英格兰岛和约鲁巴住民的X号染色体的数据。

二、软件安装首先安装bioconda，它是一个自动化管理生物信息软件的工具，安装简单，且各个软件依赖的环境一同打

包且相互隔离，非常适合在服务器中搭建生信分析环境。#

下载和安装miniconda$ wget

https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest-Lin ux-x86_64.sh#下载完成后在终端中安装$bash

Miniconda-latest-Linux-x86_64.sh按照提示安装，完成后$source ~/.bashrc #使以上的安装立即生效#输入以下命令

检验miniconda是否安装成功$ conda list显示如下图信息说明安装成功

然后利用conda install 软件名+版本号安装软件即可，我们需要安装hisat2、stringtie、samtools三个软件，安装的命

令为：$ condainstall hisat2$ condainstall

stringtie$ condainstall samtools

三、分析流程1、使用HISAT将读段匹配到参考基因组上,

使用者可以提供注释文件，但HISAT依旧会检测注释文件没有列出来的剪切位点。2、比对上的reads将会被呈递给StringTie进行转录本组装，StringTie单独的对每个样本进

行组装，在组装的过程中顺带估算每个基因及isoform的表达水平。3、所有的转录本都被呈递给StringTie的merge

函数进行merge，这一步是必须的，因为有些样本的转录本可能仅仅被部分reads覆盖，无法被第二步的StringTie组

装出来。merge步骤可以创建出所有样本里面都有的转录本，方便下一步的对比。4、merge的数据再一次被呈递给

StringTie，StringTie可以利用merge的数据重新估算转录本的丰度，还能额外的提供转录本reads数量的数据给下一步的ballgown。5、Ballgown从上一步获得所有转录本及其丰度，根据实验条件进行分类统计。

四、实战

首先使用hisat2进行比对，具体用法：hisat2 [options]* -x {-1 -2 | -U | –sra-acc } [-S ]主要参数：-x ：参考基因组索引文件的前缀。

-1 ：双端测序结果的第一个文件。若有多组数据，使用逗号将文件分隔。Reads的长度可以不一致。

-2 ：双端测序结果的第二个文件。若有多组数据，使用逗号将文件分隔，并且文件顺序要和-1参数对应。Reads的长度可以不一致。

-S ：指定输出的SAM文件。由于该样本采用双端测序，文件数稍多，利用脚本一次性执行$ for i in ;dohisat2 -p 4 -x chrX_data/indexes/chrX_tran -1

chrX_data/samples/ERR$_chrX_1.fastq.gz -2

chrX_data/samples/ERR$_chrX_2.fastq.gz -S

ERR$_chrX.samdone将该脚本保存为1.sh，在终端中运行即可，即：sh ~/脚本/所处/位置/1.sh脚本执行完即可得到右图中12个sam文件。SAM(Sequence Alignment/Map)格式是一种通用的比对格式，用来存储reads到参考序列的比对