《动物细胞制药》PPT课件 (2)
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第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
动物细胞工程制药
离心 离子交换层析 凝胶过滤 亲和层析 盐析和有机溶剂沉淀 透析 高效液相层析
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞
第3章 动物细胞工程制药
➢ 又如，HIV蛋白微球（microbicides）在局部使用可以
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
《动物细胞培养》课件
用于生产疫苗、生物制药品、研发新型材料等。
结论
动物细胞培养的意义不仅限于学术研究，还在医学和工业领域有着广泛的应用。随着技术的不断进步，动物细 胞培养的未来将更加精确和高效。
《动物细胞培养》PPT课 件
动物细胞培养是一种在实验室中培养和繁殖动物细胞的技术。本课件将介绍 动物细胞培养的简介、工具和材料、细胞的来源、细胞培养的步骤、常见的 细胞培养技术等内容。
简介
动物细胞培养是一种在实验室中使用培养基和合适的条件培养和繁殖动物细 胞的技术。它可以为生物医学研究、药物开发和工业生产提供可靠的细胞模 型。
工具和材料
细胞培养箱
用于提供恒定的温度、湿度 和CO2浓度，以模拟生理环 境。
细胞培养板
用于培养和分离细胞的平底 容器，常用的有培养皿和培 养瓶。
培养基
提供细胞生长所需的营养物 质和生长因子。
无菌枪
用于无菌操作，将细胞和培养基转移到细胞培 养板中。
纯化水
用于制备无菌的培养基和洗涤细胞。
细胞的来源
人体细胞培养
使用人类组织或细胞来源的细胞，如肾细胞、肺细 胞、肝细胞等，用于研究人类疾病和药物筛选。
动物细胞培养
使用其他动物的组织或细胞，如小鼠细胞、猪细胞、 狗细胞等。
细胞培养的步骤
1
细胞的收集和分离
从组织样本中收集细胞，并将其分离为
将分离后的细胞接种在细胞培养
2
单个细胞，以便于培养和繁殖。
板中
将单个细胞或细胞悬液转移到含有培养
基的细胞培养板中。
3
加入培养基和营养物质
提供细胞所需的营养物Байду номын сангаас和生长因子，
以促进细胞的生长和增殖。
细胞的观察和检测
结论
动物细胞培养的意义不仅限于学术研究，还在医学和工业领域有着广泛的应用。随着技术的不断进步，动物细 胞培养的未来将更加精确和高效。
《动物细胞培养》PPT课 件
动物细胞培养是一种在实验室中培养和繁殖动物细胞的技术。本课件将介绍 动物细胞培养的简介、工具和材料、细胞的来源、细胞培养的步骤、常见的 细胞培养技术等内容。
简介
动物细胞培养是一种在实验室中使用培养基和合适的条件培养和繁殖动物细 胞的技术。它可以为生物医学研究、药物开发和工业生产提供可靠的细胞模 型。
工具和材料
细胞培养箱
用于提供恒定的温度、湿度 和CO2浓度，以模拟生理环 境。
细胞培养板
用于培养和分离细胞的平底 容器，常用的有培养皿和培 养瓶。
培养基
提供细胞生长所需的营养物 质和生长因子。
无菌枪
用于无菌操作，将细胞和培养基转移到细胞培 养板中。
纯化水
用于制备无菌的培养基和洗涤细胞。
细胞的来源
人体细胞培养
使用人类组织或细胞来源的细胞，如肾细胞、肺细 胞、肝细胞等，用于研究人类疾病和药物筛选。
动物细胞培养
使用其他动物的组织或细胞，如小鼠细胞、猪细胞、 狗细胞等。
细胞培养的步骤
1
细胞的收集和分离
从组织样本中收集细胞，并将其分离为
将分离后的细胞接种在细胞培养
2
单个细胞，以便于培养和繁殖。
板中
将单个细胞或细胞悬液转移到含有培养
基的细胞培养板中。
3
加入培养基和营养物质
提供细胞所需的营养物Байду номын сангаас和生长因子，
以促进细胞的生长和增殖。
细胞的观察和检测
生物化学动物细胞工程制药(ppt)
COS细胞（非洲绿猴肾细胞）： 1981年，Gluzman用复制起点缺失的SV40(猿猴空泡
病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1，获得3个细胞系： COS-1、 COS-3 、 COS-7。
❖ COS细胞组成性表达SV40大T抗原，带有SV40 ori复制子 的质粒以附加体的形式高拷贝扩增（105 拷贝）
形态常为球形，可悬浮培养。
3、兼性贴壁细胞
不严格的依赖支持物 某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。
二、动物细胞的生理特征 动物细胞培养的一些基本概念： 动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养（继代 培养）。
原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的 过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。
细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的 方式进行细胞融合，方法有3种：生物方法（病 毒）、化学方法（PEG）、物理方法（电融合）
目前，常用的为PEG和电融合。
（1）病毒诱导融合 可促进细胞融合的病毒有：疱症病毒、天花
病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。 仙台病毒为副黏液病毒的一种，对人危害小
而且有效，使用最广。 起融合作用的为病毒被膜上
一、动物细胞的形态
离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。 根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细 胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。
1、贴壁依赖型 绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存
和生长。
按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类。
（1）成纤维细胞型
❖ 大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质，易回收和分析
❖ 易培养、易转染。
CHO-K1细胞：
1957年，Puck等从中国仓鼠卵巢分离，上皮样细胞。
CHO-dhfr- 为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次 黄嘌呤、胸苷)，用于工程细胞构建。
病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1，获得3个细胞系： COS-1、 COS-3 、 COS-7。
❖ COS细胞组成性表达SV40大T抗原，带有SV40 ori复制子 的质粒以附加体的形式高拷贝扩增（105 拷贝）
形态常为球形，可悬浮培养。
3、兼性贴壁细胞
不严格的依赖支持物 某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。
二、动物细胞的生理特征 动物细胞培养的一些基本概念： 动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养（继代 培养）。
原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的 过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。
细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的 方式进行细胞融合，方法有3种：生物方法（病 毒）、化学方法（PEG）、物理方法（电融合）
目前，常用的为PEG和电融合。
（1）病毒诱导融合 可促进细胞融合的病毒有：疱症病毒、天花
病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。 仙台病毒为副黏液病毒的一种，对人危害小
而且有效，使用最广。 起融合作用的为病毒被膜上
一、动物细胞的形态
离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。 根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细 胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。
1、贴壁依赖型 绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存
和生长。
按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类。
（1）成纤维细胞型
❖ 大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质，易回收和分析
❖ 易培养、易转染。
CHO-K1细胞：
1957年，Puck等从中国仓鼠卵巢分离，上皮样细胞。
CHO-dhfr- 为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次 黄嘌呤、胸苷)，用于工程细胞构建。
《动物细胞制药》课件
1 挑战
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
转基因动物制药PPT课件
编辑课件
3
• 以下是科学家“制造” 出的最神奇、最古怪 的10种转基因动物。
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4
1、荧光鼠
• 2007年末，荧光鼠脑细胞的图片 传遍世界各地，从“福利客”超 市的宣传海报到“自然”杂志的 封面。这些五彩斑斓的脑细胞是 单个的神经元，鲜艳的色彩帮助 科学家将它们区分开来。英国哈 佛大学的杰夫-里奇曼为首的科 研小组在实验鼠的基因组中导入 水母的绿色荧光蛋白基因，使其 在紫色光线的照射下呈现出绿色 荧光。这种绿色荧光基因对小鼠 无害，只起到标记作用。
•
研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶
(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运
动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量
乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员
也会发生肌肉痉挛。
•
科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化
能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也
能跑4到5个小时。这种老鼠最多能以每分钟20米的速
被疟原虫感染不会杀死普通蚊子，但是会降低其繁殖率。
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7、超级老鼠
编辑课件
14
• 一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、 拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国 科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人 们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，
改善人类的能力？第一只超级老鼠诞生于大约4年前。 如今，科学家已经培育出500只超级老鼠。
编辑课件
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6. 转基因蚊子
• 伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具 有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将 大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的 产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能 力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。
动物细胞工程制药-2
灌流式操作
定义：当细胞和培养基一起加入反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部 分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培 养基
灌流式操作是近代用动物细胞培养生产各种 药品最受推崇的方式
优点：①细胞可处在较稳定的良好环境中，营 养条件较好，有害代谢废物浓度较低。②可极 大地提高细胞密度，一般都可达107-108个/时， 从而极大地提高了产品产量。③产品在罐内停 留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利 于产品质量的提高。④培养基的比消耗率较低，
半连续式操作
定义：当细胞和培养基一起加人反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段 时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养 基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样 数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续 培养
半连续式操作在动物细胞培养和药品生产中 被广泛采用
优点：操作简便，生产效率高，可长时期进 行生产，重复收获产品，而且可使细胞密度 和产品产量一直保持在较高的水平
缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。④可采
用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生 物反应器，气升式反应器等
结团培养：1980年首创，该方法用细胞本身作 为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培
养
优点：操作简便，节省了用于微载体的成本
二、动物细胞培养的操作方式
分批式操作
补料-分批（或流加式）操作
冶金研究所等单位制备成功一批葡聚糖类（MC-1
型、CT-1型、CT-3型）、聚苯乙烯类（SH-2型、 PS-1型）和胶原类（GT-2型）等微载体
微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面 积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的
动物细胞制药
6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰 、 功能与细菌不同。 功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体
游离核糖体合成蛋白质用于细胞 游离核糖体合成蛋白质用于细胞 质基质内。 质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋白质 粗面内质网的核糖体合成蛋白质 是分泌的和膜中的整合蛋白，多为糖 是分泌的和膜中的整合蛋白， 蛋白。 蛋白。 原核生物缺少粗面内质网结构。 原核生物缺少粗面内质网结构。
2、悬浮细胞 、 生长不依赖支持物表面 支持物表面， 生长不依赖支持物表面，在培养液 中呈悬浮状态生长。 中呈悬浮状态生长。 淋巴细胞 细胞； 如：淋巴细胞；血液白细胞 3、兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。 生长不严格依赖支持物。 中国地鼠卵巢细胞；小鼠L929细胞 如：中国地鼠卵巢细胞；小鼠L929细胞
4、动物细胞对周围环境十分敏感。 动物细胞对周围环境十分敏感。 渗透压、pH、离子浓度、剪切力、 对培养基要求高。 动物细胞对培养基要求高。 12种必需氨基酸 种必需氨基酸、 种以上维生素、 12种必需氨基酸、8种以上维生素、 无机盐、微量元素、葡萄糖、 无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长 因子、贴壁因子等。 因子、贴壁因子等。
⒈贴壁细胞 细胞生长须有贴附的支持物表面 生长须有贴附的支持物表面， 细胞生长须有贴附的支持物表面，自身 分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表 面上生长、增殖。 面上生长、增殖。绝大部分哺乳类细胞尤其 是正常细胞。 是正常细胞。 两种形态： 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型 细胞型； 成纤维细胞型； 上皮细胞型 例如：Hela细胞 巨噬细胞； 细胞； 例如：Hela细胞；巨噬细胞；神经细胞
电穿孔法： 电穿孔法：借助电穿孔仪的高压脉冲 电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞 沿小孔进入细胞。 外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较 但是进入的DNA拷贝数低。 拷贝数低。 高，但是进入的 拷贝数低
生物技术制药第第三章动物细胞制药优秀课件
2021/3/3
4
第一节 概述
一、动物细胞培养的历史 二、细胞工程学 三、动物细胞制药发展历史
2021/3/3
5
动物细胞工程制药
两大内容：
在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞以获得多肽和 蛋白质药物；
按照预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理，采用
遗传操作技术定向改造动物细胞及动物细胞的遗传性状，
Vacanti Mouse：人耳鼠
2021/3/3
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2021/3/3
14
三、动物细胞制药的发展历史
1949年，Enders及其同事用哺乳动物原代细胞生产灭活脊髓灰质炎病 毒疫苗，开创了先河。
1986年用淋巴母细胞Namalwa生产干扰素批准用于临床。此后，Vero 细胞生产狂苗和脊髓灰质炎疫苗大量应用。
Cellular engineering includes tissue engineering and bioprocess engineering. Tissue engineering involves the use of living cells in the development of
2021/3/3
8
动物细胞体外培养历史上的里程碑
20世纪50年代，各种培养操作技术、培养器皿和培养基孕育而生。 Earle首创单个细胞克隆培养方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔 组织细胞系。
1951年，Gay建立了第一个上皮型细胞系——人宫颈癌Hela细胞系。 1957年，Dulbecco采用胰酶消化处理组织块，用液体培养的方法获得
1897年 Loeb从血液和结缔组织中分离细胞可在血清和血浆中存活 1903年 Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂 1907年 Harrison无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织，观察到神经
动物细胞工程制药PPT课件
鼠肾细胞、淋巴细胞。 缺点：需要大量动物，费钱费劳力。
生产用动物细胞的获得
⒉ 二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多
种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具 有一定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
生物反应器设计的关键：
如何提高氧的传质速率？
三、动物细胞的生理特点
S ⒈ 细胞的分裂周期长 G1
细胞分裂时间为12～48h。
G0
分裂周期 = 间期 + 分裂期
↓
↓
（G1+S+G2） （M）
G2 M
动物细胞生理特点
G1期：4～6h 合成DNA聚合酶， RNA合成。
S期：6～8h DNA合成。 G2期：2～5h DNA量加倍,
⒉ 基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
RNA合成。 M期：0.5～1h 染色体分裂。
动物细胞生理特点
动物细胞生理特点
⒉ 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象
动物细胞生理特点
⒊ 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
➢ 原代培养：细胞从机体取出后立即培养。经 传代后成为有限细胞系。
➢ 细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种 传代细胞称为细胞株。
一、动物细胞的形态
• 适应功能,形态各异——分化 • 离体培养细胞分两类：
贴壁细胞 悬浮细胞
动物细胞的形态
⒈贴壁细胞 生长须有贴附的
支持物表面，自身分 泌或培养基中提供的 贴附因子才能在该表 面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型
生产用动物细胞的获得
⒉ 二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多
种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具 有一定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
生物反应器设计的关键：
如何提高氧的传质速率？
三、动物细胞的生理特点
S ⒈ 细胞的分裂周期长 G1
细胞分裂时间为12～48h。
G0
分裂周期 = 间期 + 分裂期
↓
↓
（G1+S+G2） （M）
G2 M
动物细胞生理特点
G1期：4～6h 合成DNA聚合酶， RNA合成。
S期：6～8h DNA合成。 G2期：2～5h DNA量加倍,
⒉ 基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
RNA合成。 M期：0.5～1h 染色体分裂。
动物细胞生理特点
动物细胞生理特点
⒉ 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象
动物细胞生理特点
⒊ 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
➢ 原代培养：细胞从机体取出后立即培养。经 传代后成为有限细胞系。
➢ 细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种 传代细胞称为细胞株。
一、动物细胞的形态
• 适应功能,形态各异——分化 • 离体培养细胞分两类：
贴壁细胞 悬浮细胞
动物细胞的形态
⒈贴壁细胞 生长须有贴附的
支持物表面，自身分 泌或培养基中提供的 贴附因子才能在该表 面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型
动物细胞制药
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无血清培养基中一般需要加入：
A、激素和生长因子； B、结合蛋白； C、贴附和伸展因子； D、其他利于细胞生长的因子和元素：如消除氧自 由基损害的谷胱苷肽，微量元素如硒等。
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第四节 动物细胞培养的方式和操作方法
一、动物细胞大规模培养的方法 根据培养细胞的种类分为原代细胞培培养和传代细胞培 养，也可以根据培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转 培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固体床和流
D、微载体的比重在1.030—1.045g/ml，使载体在低速搅拌下可
以悬浮，而静止时又可很快沉淀，便于换液和收集；
E、粒径在60-250μm（溶胀后）之间为好，且要尽可能均一，
差异不大于20μm。有利于细胞均匀分布在各微载体表面；
F、具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载
体上的生长情况；
聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等。 B、糖类：
纤维素、琼脂、琼脂糖、K—卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰 几丁质等。 C、蛋白质：
胶原、明胶、纤维蛋白等。 这些材料是靠温度的变化来变相的，如海藻酸钙，在钠盐 时是液态。形成钙盐时则形成凝胶。 凝胶的制备常常是在形成凝胶后，再用另外一种电荷相反 的材料与之作用，使载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内 的载体液化。
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葡
聚
糖
凝
胶
专
用
柱
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理想的微载体应该具备的条件：
A、微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸
展和增殖；
B、微载体的材料无毒性。对培养细胞无毒性，还要不会产生影
响产品和人体健康的有害因子；
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⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： ㈠病毒载体
牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒 、
杆状病毒 ㈡质粒载体
牛痘病毒： 用构建多价疫苗
腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。
杆状病毒： 用于外源基因表达。
其作为载体的 优点： ①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正
目前，动物细胞培养技术已经广泛应用于病毒学，免疫学， 遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术 等各个领域。
4、动物细胞培养的类别
1、动物组织培养 2、动物细胞培养 （1）细胞团块单层培养 （2）单细胞克隆株培养 3、原代细胞培养 （1）初代培养 （2）细胞株确立培养 4、细胞继代培养
第二节 动物细胞的生理特点
该细胞株适于用于多种病毒的 增殖，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎 、
狂犬病毒等，现重组的多种疫苗 已投放市场。
复习与作业
• 何谓动物细胞工程制药？有何优点？ • 生产用动物细胞有何要求？如何获得动物工程细胞？
四、基因工程细胞构建和 筛选
在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。
动物细胞蛋白质的合成部位： ⑴游离核糖体 ⑵粗面内质网的核糖体
游离核糖体合成蛋白质用于细胞 质基质内。
粗面内质网的核糖体合成蛋白质 是分泌的，并在膜中整合修饰为蛋 白多糖、糖蛋白等，由粗面内质网 提供膜形成大囊泡分泌出胞外。
动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量
低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译
后修饰糖基化，与天然产品一 致。
第三节 生产用动物细胞的 要求和获得
一、生产用动物细胞的要求 ⒈原代细胞 ⒉二倍体细胞系 ⒊转化细胞系
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞
是直接取自动物组织器官,经过粉 碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞
• （2）成熟----以人的 肿瘤细胞与组织为材 料建立的各种细胞系 ，如Hela细胞系。
3、动物细胞培养的优点
（1） 细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。 （2） 理化环境可控制，培养物可直接被观测。 （3） 提供大量均一的细胞供制备用。 （4） 便于进行人工筛选。 （5） 结合显微影相技术，可观察细胞代谢活动和反应。
BHK-21:从5只无性别的生长1天的地 鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞, 核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛 血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒 、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建，表达重 组凝血因子 。 Ⅷ已投放市场，用于治疗血友病
Vero：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n= 60；培养基为199培养基， 加5%胎牛血清。
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞
⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，
自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。
两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型
动物细胞贴壁生长特性
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培 养液中呈悬浮状态生长。如淋巴 细胞。
、 淋巴细胞。
⒈原代细胞培养
定义：从新鲜供体取得组 织细胞后在体外进行首 次培养，一般持续1－4 周。
步骤：取材---组织分离--培养
⒉二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆，
从多种细胞成分的组织中，挑 选并纯化出某种具有一定特征
的细胞株。
二倍体细胞的培养意义
二倍体细胞： （1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。 （2）培养条件下只具有有限的生命力，不能进行无限期的分裂繁殖。 （3）无致癌性。
培养意义： 二倍体细胞保留着在位组织正常的细胞性状。 （1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药物的生产。 （2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老的研究、以及药物的细胞毒
性、环境污染的细胞学检测。
⒊转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体， 失去正常细胞特点，而获得无 限增殖能力。转化过程可以是 自发的，和人工的，从肿瘤组 织中。
第五章 动物细胞制药
第一节
• 1、动物细胞培养的定义 动物细胞与组织培养 是从动物体内取出细 胞或者组织，模拟体 内的生理环境，在无 菌、适温和丰富的营 养条件下，使离体细 胞或者组织生存、生 长并维持结构和功能 的一门技术。
概
述
2、动物细胞培养的历史
• （1）开始----1907， Harrison用蝌蚪的髓 管放于一滴淋巴液内 ，培养出神经元。
三、生产常用动物细胞 的特性
MRC-5：从正常男性肺组织中获得 的人二倍体细胞系。核型为2n=46 。 有限寿命42～46代。 培养基用加小牛血清，同工酶G6PD B型。
培养的该细胞株分泌的组织 型纤溶酶原激活因子（t-PA ）用于治疗心肌梗塞，脑栓 塞、肺栓塞等血栓病。还可 以治疗骨髓移植或化疗中出 现的中性粒细胞减少的粒细 胞集落刺激因子等疾病。
二、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）
G1期：4～6h 合成DNA聚合酶 RNA合成
S期：6～8h DNA合成 G2期：2～5h DNA量加倍,
RNA合成 M期：0.5～1h 染色体分裂
⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制 现象。
⒊兼性贴壁细胞
生长不严格依赖支持物。如中 国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞 。
（2）超净工作台
超净工作台的工作原理是 利用鼓风机驱动空气遁 过高效滤器除去空气中 的尘埃颗粒，使空气得 到净化。
100级超净工作台指标： （≥0.5цm≤3.5粒/L ）
培养瓶
培养器具
培养皿
培养板
（4）倒置显微镜
（5）纯化水装置
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 。 ⑴原代培养 ⑵有限细胞系 ⑶无限细胞系
⒋动物细胞对周围环境要求十分 严格，对理化因素很敏感：
如：渗透压、pH、离子浓度、剪 切 力、微量元素等。
⒌动物细胞对培养基要求高： 必需氨基酸、维生素、无机盐 、 微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。
⒍动物细胞蛋白质的合成途径和 修饰功能与细菌不同。