细胞冻存和复苏实验
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞的冻存和复苏实验原理
细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。
此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。
细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。
首先，培养细胞是实验的第一步。
细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。
培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。
接下来，要准备细胞冻存液。
细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。
常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。
其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。
然后进行细胞的冷冻。
将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。
低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。
细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。
在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。
冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。
细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。
复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。
一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。
此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。
总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。
细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)
细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。
打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞冷冻复苏实验报告
实验名称：细胞冷冻复苏实验实验日期：2023年11月10日实验人员：张三、李四、王五一、实验目的1. 熟悉细胞冷冻和复苏的操作步骤。
2. 掌握细胞冻存过程中的保护剂选择和浓度控制。
3. 了解不同冷冻复苏方法对细胞活力的影响。
二、实验原理细胞冷冻复苏技术是将细胞置于超低温环境中，使细胞代谢活动减缓或停止，从而实现长期保存的技术。
复苏过程是将冻存的细胞恢复到正常生理状态，使其重新生长和分裂。
三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）2. 培养基：DMEM培养基3. 保护剂：二甲基亚砜（DMSO）4. 冻存管：无菌冻存管5. 液氮：液氮罐6. 移液器：移液器、枪头7. 培养箱：细胞培养箱8. 显微镜：倒置显微镜9. 台盼蓝染色液四、实验方法1. 细胞培养：将MEF细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养至对数生长期。
2. 细胞冻存：（1）将细胞用DMEM培养基洗涤2次，收集细胞。
（2）用移液器将细胞重悬于含有10% DMSO的DMEM培养基中，使细胞浓度为1×10^6个/mL。
（3）将细胞悬液转移至无菌冻存管中，每管1.5 mL。
（4）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜。
（5）将冻存管转移至液氮罐中，长期保存。
3. 细胞复苏：（1）将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴中快速融化。
（2）将细胞悬液转移至培养皿中，加入适量DMEM培养基，置于培养箱中培养。
4. 细胞计数：用血球计数板对复苏后的细胞进行计数。
5. 细胞活力检测：用台盼蓝染色法检测细胞活力。
五、实验结果1. 细胞冻存：冻存后细胞形态正常，无死亡。
2. 细胞复苏：复苏后细胞形态正常，生长良好。
3. 细胞计数：复苏后细胞数量为1.2×10^6个。
4. 细胞活力检测：台盼蓝染色结果显示，复苏后细胞活力为95%。
六、实验讨论1. 细胞冻存过程中，选择合适的保护剂和浓度对细胞活力至关重要。
本实验中，使用10% DMSO作为保护剂，可有效保护细胞免受冷冻损伤。
细胞的复苏实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞复苏的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何将冻存的细胞恢复到适宜的生长状态。
3. 观察复苏细胞的形态变化，评估复苏效果。
二、实验原理细胞复苏是指将冻存的细胞从超低温状态恢复到正常生长状态的过程。
冻存细胞在超低温下，其代谢活动几乎停止，细胞膜和细胞器结构保持稳定。
复苏过程中，细胞需经历快速复温和缓慢复温两个阶段，以避免细胞结构和功能的损伤。
三、实验材料1. 冻存细胞（如人胚胎干细胞、小鼠成纤维细胞等）2. DMEM培养基（含10%胎牛血清）3. 灭菌的0.25%胰蛋白酶4. 灭菌的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）5. 灭菌的75%酒精6. 灭菌的移液器、吸管、培养皿、培养瓶等四、实验步骤1. 准备工作：将DMEM培养基预热至37℃，将胰蛋白酶、PBS、75%酒精等实验试剂准备齐全。
2. 复苏细胞：a. 将冻存管置于37℃水浴中预热5分钟。
b. 将冻存管取出，用无菌移液器吸取适量预热的DMEM培养基，加入冻存管中，轻摇使细胞与培养基混合。
c. 将冻存管置于37℃水浴中，待细胞完全融化后取出。
d. 将细胞悬液用无菌移液器转移至培养皿中，轻轻吹打使细胞分散。
3. 计数：取适量细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数，计算细胞浓度。
4. 传代：a. 将细胞悬液用胰蛋白酶消化后，用PBS清洗，重新计数。
b. 根据细胞浓度，按1:2或1:10的比例传代至新的培养瓶中。
5. 培养：将传代后的细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，观察细胞生长情况。
五、实验结果1. 细胞复苏成功，细胞活力较高。
2. 细胞形态正常，呈典型的纺锤形。
3. 细胞生长旺盛，分裂速度较快。
六、实验分析1. 冻存细胞在复苏过程中，需注意以下几点：a. 快速复温：避免细胞在复苏过程中受冻害。
b. 轻轻吹打：避免细胞在吹打过程中受到损伤。
c. 适量传代：避免细胞过度拥挤，影响生长。
2. 冻存细胞的复苏效果与冻存时间、冻存方法等因素有关。
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存：一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里，细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。
今天呀，我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿，这里面的门道可多着呢，就像走钢丝，容不得半点马虎。
一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一：前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前，得把“战场”布置好。
先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍，就像给它做个全面的SPA，确保里面一尘不染。
接着，打开水浴锅，把水温调到37℃，这温度可不能出差错，多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了，少一度就像是在冷水里打哆嗦，都不利于细胞恢复生机。
准备好相应的培养液，这就像是细胞的“营养套餐”，没它细胞可活不下去。
步骤二：复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候，感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。
那冻存管冻得直冰手，得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻，要不停地轻轻晃动，就像是在鼓励细胞：“小宝贝们，快快醒来啊！”这时候心里默默祈祷着，可别出啥岔子。
在小细胞们还迷糊着的时候，把它们转移到含有培养液的离心管里，离心的过程又像一场小小的筛选，把那些还没适应过来的杂质去除，留下顽强的细胞。
最后把细胞接种到培养瓶里，就像给它们安家落户啦，盼着它们在新家里茁壮成长。
二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一：选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。
一般是包括培养液、血清和保护剂（像是二甲基亚砜这类的神奇物质）。
血清就像保护层里的柔软衬里，给细胞温暖的呵护，而保护剂则像坚韧的外壳，防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。
这三者的比例得拿捏得死死的，就像厨师做菜时放盐的量，多一点少一点都不行。
步骤二：缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里，标记好细胞类型、日期等信息，这就好比给细胞上户口，省得以后找不到“人”。
然后要进行程序降温。
想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物，得一步步慢慢适应越来越冷的环境。
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。
(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。
2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。
3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。
(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。
(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。
4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。
(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。
(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。
5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
实验五 冻存细胞的复苏
【目的要求】
1、掌握细胞冻存与复苏的基本原理。
2、掌握细胞冻存与复苏的基本过程。
【实验用品】
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、器材：超净工作台、恒温培养箱、微镜、 倒置相差显微镜、水浴箱等。
2、试剂：PBS、高糖DMEM培养液（含10 ％FBS和1%双抗）、0.25%胰蛋白酶、75% 酒精。 3、材料：小鼠胚胎成纤维细胞。
最常用的保护剂为二甲基亚砜（DMSO）溶解和甘油溶液， 它们具有对细胞无毒性、分子量小、溶解度大、易穿透细 胞的特点。使用浓度范围在5%～15%之间，常用10%的浓 度。
二、细胞的复苏
细胞复苏与冻存的要求相反，速度要快，
使之迅速通过细胞易受损的-5～0℃后，细
胞仍能生长，活力不受损害。
【方法与步骤】
WST-1检测 （2） 第3天 （3）
第5天 （1）
第2天
向你的样品中每孔加10微升底物WST
【作业与思考题】
1、简述细胞冻存和复苏的基本原理【思考
题】 。
2、简述细胞冻存和复苏的基本过程【作业
题】 。
3、实验结果分析【作业题】 。
上次实验为： MTT法细胞活力测定
实验报告书写内容-作业：
【实验原理与方法】
细胞的冻存原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细
胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变
化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、 pH 值改变、蛋白质变性等，导致细胞死亡。但如果在培养液
中加入保护剂如甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点
降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前析出 细胞外，可使细胞免受损伤。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。
4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。
3.离心，1 000 rpm，5 min。
4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液，继续培养。
四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
生物医药学中细胞冻存和复苏实验
生物医药学中细胞冻存和复苏实验细胞冻存和复苏应用领域：(1)用于生物学保种;(2)用于医学上干细胞研究;(3)用于传代培养。
细胞冻存和复苏原理细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主要材料细胞试剂、试剂盒：D-Hanks液小牛血清培养液青霉素链霉素胰蛋白酶 HCl NaHCO3 DMSO 甘油耗材设备：微量加样枪吸头离心管冻存管枪头胶塞移液管玻璃瓶红血球计数板记号笔医用橡皮膏移液枪超净工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱液氮冰箱步骤说明：一、材料准备1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管(弯头、直头)、培养瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、废液缸。
3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管(10ml)、15ml离心管、冻存管(1～2ml)。
注意事项1. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液。
2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
3. 冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存和复苏其他说明一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶;相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。
依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。
（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。
用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。
（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。
以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。
以后取出冻存管移入液氮容器内。
在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。
细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。
细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。
因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。
（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。
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实验步骤一、材料准备
1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。
3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。
4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。
5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。
二、细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。
3. 离心1 000 rpm，5 min。
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
三、细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。
3. 离心，1 000 rpm，5 min。
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
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注意事项1. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液。
2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
3. 冻存和复苏最好用新配制的培养液。
其他一、冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、慢冻程序
1. 标准程序：采用细胞冻存器
当温度在-25 ℃以上时， 1~2 ℃/min；
当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min；
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2. 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min 内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。
3. 传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高
胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法
1. 预先配制冻存液
（1）10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）
（2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）
2. 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）。
3. 加入1 ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
液氮长期保存。
五、保存细胞的复苏方法
1. 快速解冻
冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
2. 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。
3. 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。