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第三章蛋白质一级结构的测定

第三章蛋白质一级结构的测定

不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2+ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O-
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸(酸性氨基酸)
O H2N H3N+ CH C CH2 C OH O
O- OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2+ O- 3N N-CH-C-OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容: ①多肽链的数目; ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序; ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证

测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外,均为氨基酸,除甘氨酸外都是L-型。

不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸

对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

第三章 蛋白质一级结构及测定

第三章 蛋白质一级结构及测定

③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二 硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试 剂,只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原,反应基本与 疏基乙醇相似,且在许多球蛋白反应中,可以不用变性剂。
还原蛋白不稳定,SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定 SH基的方法可用烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生 物。
它能选择性 地切割由甲 硫氨酸的羧 基所形成的 肽键
R1 O + HO -CH-C-N-CH-C=NH-CH-C~ 2 Br O H2C O CH2 + CH2-S-C N ¼»ÁÇË ×ùòèá R H O H 2O +-CH-C-N-CH-C O O H2C-CH2
R
H
R1 O H2N-CH-C~ C¶ ë ¶ NÄ ¶ ËÄÎ ©Ë
R1 R2 Rh H2N-CHCO~NH-CHCO~NH-CHCOOH R1 R2 õë £Â õë £Â £±¼È³Ìõ뻺Σ ¨½×©éá£Â¯Ïï© Î Ë NH2NH2 Þ® o 100 C 5~10h Rh
H2N-CH-CONHNH2+H2N CH CONHNH2+....+H2N-CH COOH
OH- pH9 —
苯异硫氰酸酯 ( PITC ) S
=
②与Edman试剂反应的 产物为:苯乙内酰硫脲氨 基酸(PTH-氨基酸) ③PTH-氨基酸可用乙 酸乙酯抽提,再用纸层析 或薄层层析鉴定
S C
-NH-C-NHCHCO-NHCHCO —
苯氨基硫甲酰多肽 (氨基酸)
S-C C N H - —
R H+ O

蛋白质一级结构的测定

蛋白质一级结构的测定

05
蛋白质一级结构测定的应用 与展望
在生物科学研究中的应用
蛋白质功能研究
通过测定蛋白质一级结构,可以 深入了解蛋白质的功能和作用机 制,为生物科学领域的基础研究 提供重要信息。
生物进化研究
蛋白质一级结构的比较分析有助 于揭示生物进化的规律和机制, 为生物进化研究提供有力支持。
生物标志物发现
蛋白质一级结构的测定可以为生 物标志物的发现和鉴定提供依据, 有助于疾病预警、诊断和治疗。
详细描述
序列分析法是测定蛋白质一级结构最直接的方法,包 括Edman降解法、化学裂解法、质谱法等。Edman 降解法是通过将蛋白质一级结构中的每个氨基酸残基 依次进行化学修饰和测序,从而确定氨基酸的排列顺 序。化学裂解法则是利用化学试剂将蛋白质分解成较 小的肽段,再测定每个肽段中氨基酸的组成和排列顺 序。质谱法则通过分析蛋白质的离子化特性来确定氨 基酸序列。
质谱技术的优势与局限性
优势
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高 准确性等优点,能够快速准确地测定蛋 白质一级结构,且样品需求量少,适用 于大规模蛋白质组学研究。
VS
局限性
质谱技术对于样品纯度和分子量范围有一 定的要求,对于复杂样品和低丰度蛋白质 的测定仍存在挑战。同时,质谱仪器成本 较高,操作和维护较为复杂。
肽质量指纹图谱
通过将蛋白质酶解成肽段,利用质谱技术分析肽段的质量, 可以获得肽质量指纹图谱,用于蛋白质的鉴定和一级结构 的测定。
串联质谱
串联质谱技术通过将肽段离子进一步裂解,产生更小的片 段离子,从而更精确地测定肽段序列和氨基酸组成,进一 步确定蛋白质一级结构。
磷酸化位点测定
质谱技术还可以用于磷酸化位点的测定,通过分析磷酸化 肽段的离子,可以确定磷酸化位点和磷酸化类型。

蛋白质化学一级结构及分析PPT课件

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+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-
Leu-脑啡肽
C ys Tyr Phe S G ln S A sn C ys P ro A rg G ly N H 2
牛牛催催产产 素素
牛牛加加压压素 素
第11页/共94页
OH
CH3 CH CH2OH
CH O
O
O
HN CH C NH CH C NH CH2 C
In 1992, the Sanger Centre in Cambridge, named after Frederick Sanger, was founded by th第e 3W3页el/共lc9o4m页e Trust and the British
Sanger试剂(FDNB)标记N末 端
• 1943-53年,Sanger确定了牛胰岛素 的 一 级 结 构 , 1 9 5 8 年第获32页得/共N94页o b e l 化 学 奖 ;
科学怪才 Fredrick
Sanger •

两获诺贝尔奖 (仅4人), 唯一两获诺贝 • 尔化学奖。
Frederick Sanger (1918- ) is a British
Peptides and Proteins
• 氨基酸的多聚物,分子量大小差异极大,可以是2 或3个到成千上万个氨基酸残基连接而成。
• 两个氨基酸残基之间通过共价的酰胺键(肽键)连 接形成一个二肽;三个氨基酸残基连接成三肽;…; 有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽;多个氨 基酸残基则连接成多肽;蛋白质可以是成千上万个 氨基酸残基连接而成。
第17页/共94页
多肽具有特征性的氨基酸 组成,多肽或蛋白质以酸 水解产生游离-氨基酸的 混合物。当完全水解时, 每一种类型的蛋白质产生 一种特征性的氨基酸比例 或混合物。20种氨基酸 几乎从不以相同的比例出 现在一个蛋白质中,有高 有低,甚至有的只出现一 次或根本不出现。

第三章蛋白质一级结构的测定

第三章蛋白质一级结构的测定
其中最重要的是多肽链的
氨基酸顺序,它是蛋白质生
物功能的基础。

包括以下几方面内容:
①多肽链的数目;
②每条多肽链中氨基
酸的种类、残基数目和
排列次序;
③链内或链间二硫键
的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段

裂解后肽段的分离纯化方便

选择裂解试剂困难
2. 测定一级结构的准备工作

对样品纯度的要求

对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种


蛋白质的氨基酸组成

蛋白质的配基

蛋白质的端基分析
样品必需纯(>97%以上)
……

常用来检测蛋白质样品均一性的方法有:
①双向分析电泳;
②在解离条件下的凝胶电泳;
-按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
非极性R基团氨基酸
O
H
H 32NN+
CH
C
CH
CH
CH
O-
OH
3
3
-氨基异戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
亮氨酸
Leucine
非极性R基团氨基酸
O
HH3N2 N+
CH
CH
2
CH
CH
O

HH3N
2N
CH
CH
C
OH
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用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱 水解(针对色氨酸分析)或酶水解后,用氨基酸自动分析 仪测定; 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量;用Edman反 应分析各肽段氨基酸顺序;
⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解
获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重 叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序; 确定多肽链中二硫键的位置。
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下,用过量的-巯基乙醇处理,使二硫键 还原为巯基;
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂,用烷基化试 剂保护生成的巯基,防止其重新被氧化;
如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体;可用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基)。
蛋白质的一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的 测定是蛋白质化学研究 的基础。
自从1953年F.Sanger 测定了胰岛素的一级结 构以来,现在已经有上 千种不同蛋白质的一级 结构被测定。
蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
(1)测定蛋白质的一级结构的要求
A. 样品必需纯(>97%以上); B. 知道蛋白质的分子量; C. 知道蛋白质由几个亚基组成; D. 测定蛋白质的氨基酸组成;并根据分子量
Ile(I)、Met(M)、Val(V)及其它疏水性强的AA 水解速度较快
➢ 木瓜蛋白酶:
专一性差 断裂位点:对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
➢ 葡萄球菌蛋白酶:
高专一性 断裂位点:Glu和Asp残基的羧基端肽键
——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液)
➢ 梭菌蛋白酶:
糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)
O
O
O
O
NH CH C NH CH C NH CH C NH CH C
R1
R2
R3
水解位点
R4 肽链
• 特点:专一性稍弱,Leu、Met和His稍慢 • 断裂位点:Phe(苯丙)、Trp(色)、Tyr(酪)等疏水氨基
酸残基的羧基端肽键 • R1=Phe(F)、 Trp(W)Tyr(Y)等疏水性AA • R2=Pro(抑制)
C末端的测定
羧肽酶法;硼氢化锂法;肼解法
N末端的测定
N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确,主要的 方法有:
二硝基氟苯法(DNFB法)
肽链N末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应,生成二 硝基苯的衍生物(DNP-肽),其经酸水解后生成的DNP-氨 基酸可用有机溶剂(如乙酸乙酯)抽提,再与其他氨基酸分 开,鉴定得知N末端的氨基酸。
2、多肽链氨基酸顺序分析
• 多肽链降解必须满足两个条件: 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法
酶解法
某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的 某一类肽键;
主要有胰蛋白酶,糜蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热 菌蛋白酶,羧肽酶和氨肽酶;
糜蛋白酶(chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸;水解法,它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
溴化氰水解法(Cyanogen bromide)
---选择性地切割由Met羧基形成的肽键
CH3 S:
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
Leu(L)及其它疏水性AA水解速度较快 • R1=Pro(抑制) • pH2.0
嗜热菌蛋白酶(thermolysin)
➢ 特点:专一性较差 ➢ 断裂位点:Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏
水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 • R2=Phe(F)、 Trp(W)、 Tyr(Y)、Leu(L)、
胃蛋白酶(pepsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮 氨酸、以及其他疏水性强
胰蛋白酶(trypsin)
O
O
NH CH C NH CH C
R1
R2
水解位点
O NH CH C
R3
O NH CH C
R4 肽链
• 特点:专一性较强,水解速度快 • 断裂位点:赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 • R1=Lys(赖、K)和Arg(精、R) • R2=Pro(抑制)
★巯基的保护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
CH2OCCl
-OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
-OOC
NH3+
O
CHCH2 SCH2
O
NH3+
ICH2CNH2
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
用烷基化试剂保护生成的巯基,以防止它重新被氧化
④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺 序的测定
采用经典的阳离子交 换色谱分离、茚三酮 柱后衍生法,对蛋白 质水解液及各种游离 氨基酸的组分含量进 行分析。
②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分 子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。
③二硫健的断裂及多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子,必须先进行拆分单独分 离出来;
计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量,计算酰胺的含量。
(2)蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位
①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量,计算出构成蛋白质的各种氨 基酸的数量;
水解速度与相邻AA性质有关: 酸性:-/碱性:+
O
O
NH CH C NH CH C
R1
R2
水解位点
O NH CH C
R3
O
NH CH C
R4
肽链
胃蛋白酶 Pepsin
• 特点专一性与糜蛋白酶相似,较弱; • 断裂位点:两侧的残基都是疏水性氨基酸 • R1和/或R2=Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
高丝氨酸内酯
+ H3N+
RO CH C
(2)多肽链的末端氨基酸测定
N末端的测定
二硝基氟苯法(DNFB法);二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法);异硫氰酸苯脂法(PITC 法);
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