神经生物学的常用研究方法精品PPT课件

（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
（2）变性束路追踪法
利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近 侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元 胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的 远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。
损伤手段：
• 物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等
特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外， 也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。
HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。
基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、 神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材 作苯冰胺冻（T切M片D；）然或后二用氨双基氧联水苯（胺H（2OD2A）B及）呈显色示剂HR四P甲反基应联产 物。
将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。
只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
DRG
Spinal cord
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Fast blue labelling neurons
Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组 织化学、电镜技术等结合。
需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时 间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光 素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。
• 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时 间也有限。
• 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化 学结合，研究投射神经元的化学性质。
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• 优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一
种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑
内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元 胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的 轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团 或区域。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度
高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入
2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。
注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运 输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶 体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须 具体测试。
顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
五、神经生物学常用的研究方法
（一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术
（一）形态学方法
1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法
束路追踪法
研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域 的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用 最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变 性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元 质膜荧光追踪法。
Leabharlann Baidu
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HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
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b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首
先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过 轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微 镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经 纤维联系的荧光素逆行追踪法。