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第四章递质和内源性活性物质
一.关于神经递质的研究概况 二.鉴定递质的条件 三.递质的类型 四.递质受体 五.各经典递质和内源活性物质的合成、
储存、释放、灭活 六.递质共存和共释放
教学ppt
1
一.神经递质和内源性活性物质的研究概况
1.1904，Elliott，冲动传导到交感神经末梢，可能从那 里释放肾上腺素，在作用于效应器细胞。
教学ppt
10
ionotropic R（促离子通道型受体） ： 受体本身不是独立的蛋白质，它的
一或二个亚基为受体的结合位点同时又 与另外亚基共同构成离子通道，此类受 体能引起通道的快速改变，产生兴奋性 或 抑 制 性 突 触 后 电 位 ， 在 1 ms 内 产 生 在 10ms内消失。 如：nAch受体，GABAA 受体，甘氨酸 受体和谷氨酸受体（3种促离子型受体， 1种促代谢型受体），它们介导了中枢和 周围神经系统的快速突触传递。
教学ppt
11
metabotropic R (代谢型受体)：
信号通过G蛋白介导的细胞内的生物化学反应， 这种反应类似于一种代谢反应。 促代谢型型受体: 7TM， 如 ： adrenergic R，1A，1B，2A，2B， 2C；1，2，3；
DA（D1-D5） 5HT （5HT1A，5HT1B，5HT 1D，5HT 1E，5HT1F，5HT 2A，2B，2C，3-5，6） Ach（M1，M2，M3，M4，M5）
Peptide-binding R: Adrenergic R: G protein-linked R: hormone R; photoreceptor Neurokinin A R Rhodopsin: light;in retinal rod cell;7TM super family;
一.关于神经递质的研究概况 二.鉴定递质的条件 三.递质的类型 四.递质受体 五.各经典递质和内源活性物质的合成、
储存、释放、灭活 六.递质共存和共释放
教学ppt
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一.神经递质和内源性活性物质的研究概况
1.1904，Elliott，冲动传导到交感神经末梢，可能从那 里释放肾上腺素，在作用于效应器细胞。
教学ppt
10
ionotropic R（促离子通道型受体） ： 受体本身不是独立的蛋白质，它的
一或二个亚基为受体的结合位点同时又 与另外亚基共同构成离子通道，此类受 体能引起通道的快速改变，产生兴奋性 或 抑 制 性 突 触 后 电 位 ， 在 1 ms 内 产 生 在 10ms内消失。 如：nAch受体，GABAA 受体，甘氨酸 受体和谷氨酸受体（3种促离子型受体， 1种促代谢型受体），它们介导了中枢和 周围神经系统的快速突触传递。
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metabotropic R (代谢型受体)：
信号通过G蛋白介导的细胞内的生物化学反应， 这种反应类似于一种代谢反应。 促代谢型型受体: 7TM， 如 ： adrenergic R，1A，1B，2A，2B， 2C；1，2，3；
DA（D1-D5） 5HT （5HT1A，5HT1B，5HT 1D，5HT 1E，5HT1F，5HT 2A，2B，2C，3-5，6） Ach（M1，M2，M3，M4，M5）
Peptide-binding R: Adrenergic R: G protein-linked R: hormone R; photoreceptor Neurokinin A R Rhodopsin: light;in retinal rod cell;7TM super family;
神经生物学研究常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
神经生物学研究常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
神经生物学的常用研究方法ppt课件
用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
.
研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
20×
.
Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
.
优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
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研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
20×
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
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优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
神经生物学研究方法
组织培养：下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等
体 （胚胎、成年）
外
基因功能
实
原代细胞 细胞通路
验
细胞培养
膜片钳 肿瘤细胞系
细胞系
永生化细胞：P19
一、 组织培养：
下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等 （胚胎、成年）
Brain slice cultures
Both figures shows slice cultures of the cerebellum. Left picture: The typical cytoarchitectonic organization of the cerebellar cortex is maintained, and it is possible to nicely distinguish the molecular layer (ML) with the Purkinje cell dendrites (red), the Purkinje cell layer (PCL) with the Purkinje cell bodies (red) and the granule cell layer (GCL) with the granule cells. (green). Right picture: Besides the dendritic arbours, also the axonal projection of the Purkinje cells is present in the slice cultures.
电镜：观察细微结构和亚细胞机构
9
双光子显微镜：观察活细胞
• 双光子荧光显微镜是结合激光扫描共聚焦 显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
《神经生物学概述》PPT课件
一、神经生物学的形成和发展
二、神经生物学研究的方法和手段
三、神经生物学的基本内容
四、目前神经生物学研究的新动向
五、神经生物学的研究前景
一、神经生物学的形成和发展
1、 神经生物学的概念和研究范畴 l 概念：神经生物学是研究神经细胞的分子组
成和结构及神经细胞如何通过突触连接组成 功能回路以处理信息和介导行为的科学。它 是多种相关学科，如生物物理学、神经解剖 学、神经生理学、神经药理学及分子生物学 等学科交叉渗透、相互融合而派生出来的新 兴的边缘和交叉学科。
2）、神经科学研究是综合研究：从分子到行 为的“一条龙”研究，是神经科学研究的 特点。
3）、神经科学的发展在一定程度上取决于能 否寻找到合适的实验材料来对某个特定的 问题进行研究。如（1）、海兔标本对于学 习、记忆机制的阐述；（2）、枪乌贼大神 经对突触传递过程的了解；（3）、鱼类的 电器官使我们对乙酰胆碱的作用有广泛的 了解；（4）、神经分子遗传学的研究则大 大得益于线虫和果蝇所获得的资料。
3、神经生物学发展的几个特点
多学科研究 多层次研究 实验材料的重要性 现代神经科学呈现方向的多样性 知识更新很快
1）、神经科学研究是多学科的综合研究
作为一名实验科学，对神经系统的研究在很 大程度上有赖于研究手段的发展和完善。 （1）没有Golgi染色法，就不可能观察到神 经细胞的形态；（2）没有微电极的发明， 就不可能进行神经系统的电生理学研究； （3）没有免疫组织化学方法的发展，就不 可能把神经化学的研究与形态学研究有机 地结合起来；（4）没有膜片钳技术的发展， 就不可能进行单通道电流的研究。
4）、现代神经科学研究与19世纪末和20世纪 初的情势已完全不同了。在哪个时候，几
个人或几个实验室的工作会成为整个神经
神经生物学的常用研究方法
组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科 学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞 （组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反 应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位 和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色 变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位 和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求： ① 保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定 位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。 ② 具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。 ③ 具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。 ④ 生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于 原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性 具有一定的量效关系。 ⑤ 反应产物具有稳定性，以便于重复观察 ⑥ 要有重复性。 ⑦ 选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影 响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应 为双蒸水。 ⑧ 为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必 须同时作对照实验。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度 高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。 只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
神 经 生 物 学 常 用 形 态 学 研 究 方 法
神经生物学常用形 态学研究方法
组织材料的处理
1.固定(fixation) 目的：防止组织自溶，保护组织免受微生 物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失， 维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定 2.切片(section)：石蜡切片，冰冻切片
一、一般染色方法
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
40×
Doublelabelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
NOS与 NADPH-d活性的比较
• Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、 NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都 可抑制Nos • b.底物:L-Arg • NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协 同因子，只需NADPH • b；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）
NOS活性≠NADPH-d活性,使用NOS 抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来 分析NOS活性。 NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有 NOS,但不能说明有NOS 活性， NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不 含NOS.
4,Washing:去掉非特异性结合 5, Incubate in second antibody :浓度 1/100~200,二抗必须针对一抗动物种属， 二抗上结合的物质不同，显色用不同方法： ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC， PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗， 不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非 常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控 制。
组织材料的处理
1.固定(fixation) 目的：防止组织自溶，保护组织免受微生 物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失， 维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定 2.切片(section)：石蜡切片，冰冻切片
一、一般染色方法
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
40×
Doublelabelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
NOS与 NADPH-d活性的比较
• Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、 NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都 可抑制Nos • b.底物:L-Arg • NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协 同因子，只需NADPH • b；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）
NOS活性≠NADPH-d活性,使用NOS 抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来 分析NOS活性。 NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有 NOS,但不能说明有NOS 活性， NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不 含NOS.
4,Washing:去掉非特异性结合 5, Incubate in second antibody :浓度 1/100~200,二抗必须针对一抗动物种属， 二抗上结合的物质不同，显色用不同方法： ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC， PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗， 不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非 常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控 制。
神经生物学常用研究方法幻灯片课件
生命科学
解剖学 生理学 生物化学 …… ……………
了解脑
分子 细胞 网络 全脑 (离体研究) (无创在体研究) Patch（电） 脑地形图 RIA(化学） PET(化学） PCR(基因） fMRI (功能） Confocal C科学
(1990-2000 脑的十年) （人类感知和思维信 息处理过程的科学）
1906
形 态 1852 R.Cajal (西班牙)
1926
徒手切脑片 银染神经元
神经元染色方法
1934
染出神经末梢，发现神 经元之间无原生质联系
“神经元学说”
1857
生电 理生
理
C.S.Sherrington (英) 1932 Oxf 1952 1889E.D.Adrian (英) Cambridge
•“突触”定名 巴浦洛夫 （1904）
•“反射”概念 反射学说
•“交互”抑制
1977 •感觉神经纤维电活动 •传入冲动大脑诱发电位
电生理
（ 乙 神 1873
O.Loewi (德 英)1936
•神经控制骨骼肌运动机制
1961
•蛙心灌流实验
酰经 胆 化 1875 碱学 ）
1874
H.Dale (英) J.Erlanger (美) 1944
•数学方程表述
机
制
1911 B.Katz (德 英) 1970
• NM终板电位
（ 儿神
1905 U.Von Euler (瑞典…)
茶经
•递质“量子释放”
1983 •交感神经递质 神经药理学
•去甲肾上腺素
酚 化 1912 胺学 ）(左右脑)1913
J.Axelrod (美) R.W.Sperry (美)
神经生物学常用研究方法PPT课件
盖伦（129-200）：医学上的权威仅次于希波克拉底，他 认为人体具有三种灵魂，即（一）生长灵魂，这是人、动 物和植物所共有的，在人体它位于脐部；(二）动物灵魂， 这是人和动物所共有的，它位于心脏、主管感觉和运动； (三）理性灵性灵魂，这只有人才具备,位于脑部，主管智 慧。
加尔（19世纪初 ）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑 的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理 论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表） 同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象 征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生 理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保 守的阐述之外，还兼论颅相学。
16
-
Positron Emission Tomography (PET， 正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
17
-
18F-FDG PET脑代谢显 像，正常人与老年性痴呆 对照，患者双侧顶叶、颞 叶皮质对称性低代谢。
18F-DOPA PET脑受体显像， 正常人与帕金森氏病脑纹状体 多巴胺受体密度影像对照，患 者双侧纹状体密度明显减少
MRI vs MEG
21
-
Magnetic Resonance Imaging (MRI)
22
-
fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity
Oxygen consumption
Cerebral blood flow
加尔（19世纪初 ）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑 的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理 论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表） 同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象 征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生 理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保 守的阐述之外，还兼论颅相学。
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Positron Emission Tomography (PET， 正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
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18F-FDG PET脑代谢显 像，正常人与老年性痴呆 对照，患者双侧顶叶、颞 叶皮质对称性低代谢。
18F-DOPA PET脑受体显像， 正常人与帕金森氏病脑纹状体 多巴胺受体密度影像对照，患 者双侧纹状体密度明显减少
MRI vs MEG
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Magnetic Resonance Imaging (MRI)
22
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fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity
Oxygen consumption
Cerebral blood flow
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（2）变性束路追踪法
利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近 侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元 胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的 远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。
损伤手段：
• 物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等
特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外， 也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。
需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时 间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光 素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。
• 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时 间也有限。
• 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化 学结合，研究投射神经元的化学性质。
呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组 织化学、电镜技术等结合。
顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入
2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。
注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运 输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶 体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须 具体测试。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
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• 优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一
种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑
内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元 胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的 轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团 或区域。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度
高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
五、神经生物学常用的研究方法
（一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术
（一）形态学方法
1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法
束路追踪法
研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域 的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用 最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变 性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元 质膜荧光追踪法。
（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。
基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、 神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材 作苯冰胺冻（T切M片D；）然或后二用氨双基氧联水苯（胺H（2OD2A）B及）呈显色示剂HR四P甲反基应联产 物。
将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。
只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
DRG
Spinal cord
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Fast blue labelling neurons
Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of ReP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
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b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首
先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过 轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微 镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经 纤维联系的荧光素逆行追踪法。