神经生物学的常用研究方法PPT课件

呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。
2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组
顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
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常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
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HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入
2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少，
HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。
注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运 输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶 体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须 具体测试。
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（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
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• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同：
绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度 高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时 间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光 素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。
• 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时 间也有限。
• 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化 学结合，研究投射神经元的化学性质。
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• 优点：可靠性，灵敏性，
利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一 种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。
双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑 内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元 胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的 轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团 或区域。
只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
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DRG
Spinal cord
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Fast blue labelling neurons
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过 轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微 镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经 纤维联系的荧光素逆行追踪法。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。
基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、
神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材 作苯冰胺冻（T切M片D；）然或后二用氨双基氧联水苯（胺H（2OD2A）B及）呈显色示剂HR四P甲反基应联产 物。
-Βιβλιοθήκη Baidu
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将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。
五、神经生物学常用的研究方法
（一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术
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（一）形态学方法
1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法
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束路追踪法
研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域 的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用 最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变 性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元 质膜荧光追踪法。
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（2）变性束路追踪法
利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近 侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元 胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的 远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。
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损伤手段：
• 物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等
特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外， 也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。
织化学、电镜技术等结合。 -
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HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
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HRP labelling neurons in dLGN
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b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首