核与线粒体分离提取方案

线虫细胞核和线粒体提取

N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。

1.细胞核分离

细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。

方法如下：

1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合

2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。

3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。

4.以10000rpm短暂离心5-10秒。

5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中

6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次

7.用棉布过滤匀浆

8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。

10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。

11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。

12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。

核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。

13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。

14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。

分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。

2.线粒体提取

查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下：

1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。

2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。

3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。

4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。

5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。

6.小心地清除上清液

7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破

碎。注射器吹打溶胞产物。重复10次。或者使用Dounce或Potter匀浆器。

8.在4℃下将裂解物以1000x离心10分钟并小心将上清液转移到干净的1.5ml管中。颗粒含有细胞核，细胞碎片和未破碎细胞。如果需要，可以通过重复步骤7和8从细胞沉淀中再提取蛋白质使用500μl冰冷的破碎缓冲液。每次提取的上清应在下一步之前混合。

9.离心步骤8的上清液以6000×g离心10分钟4℃。

10.小心取出上清液。

11.第10步沉淀重悬到750μl线粒体纯化缓冲液中，用1ml枪头吹打。将750μl线粒体纯化缓冲液吸入2ml微量离心管并缓慢吸取在线粒体纯化缓冲液下500μl Disruption Buffer。小心吸取在线粒体纯化缓冲层顶部的线粒体悬液。

12.在4℃下以14,000xg离心15分钟。

13.小心地除去1.5毫升的上清液，不要搅动线粒体层或颗粒。

14.小心地吸取线粒体层或颗粒至一个新的管子，留下0.5ml溶液在管底并。

15.用1.5ml线粒体储存液稀释步骤14的悬液，并在4℃下以8000xg离心10分钟。

16. 吸掉1.5毫升上清液，5毫升线粒体存储缓冲液稀释剩余物悬浮液，4℃下离心8000×g 10分钟。

17.重复步骤16，直到线粒体在底部形成颗粒的管子。

18.重悬线粒体沉淀在线粒体储存缓冲液中进一步分析。

分离的线粒体可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。