核与线粒体分离提取方案
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
细胞生物学实验手册：细胞核与线粒体的分级分离
实验八细胞核与线粒体的分级分离【实验目的】通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
【实验用品】一、材料和标本小白鼠、冰块。
二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
【实验内容】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取(一)操作步骤。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核，叶绿体，线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法。
二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
细胞组分的分离在等渗溶液（0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行。
●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞。
●在3000r/min的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶，洗净搽干后去除叶梗和粗脉，称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中，放入组织捣碎机(间歇)；低速匀浆1min；间歇匀浆。
2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。
3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离。
5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮。
（浓度不要太高，不利于观察）➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。
第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
收集沉淀涂片，用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。
细胞核与线粒体的分离
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
线粒体与体细胞核移植
有 效地协 同工作是 影响核基 因组 重编程效率 的一个重 要 因 素 。ｍｔ ＤＮ Ａ 在不 同物种之间、同一物种 不同个体间均存在 大 量 的核 苷 酸差 异 ，这 种 由 ｍｔ Ｄ ＮＡ 多 态 性产 生 的不 同 ｍｔ ＤＮＡ 单倍 型也 可 导致种 内核 一线粒 体互 作产 生不 同效 应 。此外 ，克隆胚胎 中，存在受体卵母细胞和供体细胞 两种 来源 的线粒体 ， 这两种线粒体 的相互作用影 响着重 构胚 的发 育 。本文对 Ｓ Ｃ ＮＴ 中线粒 体的功能与特性 以及两种来源 的 线粒体 的异质 性及其对 克隆 效率和重 构胚发育 的影响进行
构， 增加 了供体核与卵胞质 中重编程 因子 的相 互协 调作 用使 得受体卵母细胞更容易重编程供体核［ １ 。Ｅ ｎ ｒ ｉ ｇ ｈ ｔ等＿ １ ｌ 】 用一 种 组蛋 白去乙酰化酶抑 制剂古 曲霉 素 Ａ （ Ｔ Ｓ Ａ）处理供体 细 胞，发现 Ｔ Ｓ Ａ 可增加供体核 的组 蛋白乙酰化水平 ，促进 发育相 关基 因的表达 ，提高克隆囊胚率 。 线 粒体作为 哺乳动物 细胞 中唯一具有 自身遗传物 质 的
综述和讨论 。
２ Ｓ Ｃ Ｎ Ｔ 中线 粒体 与供 体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 相容 性 的研究
核质 的互作 与协调是 细胞 正常活动的基础， 体细胞核移
植 重 构 胚 正 常核 型 的 维持 和 核 基 因 组 重 编 程 的 完 成 ， 同样 取
决于供体核 与受体 卵母细胞 的同步协调和相互作用 。 核质互
膜 内外一系列 的生化变化 ，如诱导细胞色素 ｃ 释放 ，活化 ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ蛋 白酶家族 ，呼吸链 与氧化磷酸化失偶联 ，三磷酸 腺苷合 成停止 ，线粒体膜 通透性 改变 ，释放 凋亡诱 导因子
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
实验一：线粒体和细胞核的制备与观察
染色
01
使用适当的染色剂（如甲基绿）对线粒体和细胞核进行染色，
以便在显微镜下观察。
显微观察
02
在显微镜下观察染色后的线粒体和细胞核，记录其形态、大小、
分布等信息。
图像分析
03
使用图像分析软件对显微镜下的图像进行处理和分析，提取有
关线粒体和细胞核的特征参数。
04
结果分析
线粒体和细胞核的形态特征分析
酶
用于消化细胞膜，使线粒体和 细胞核更容易分离。
所需仪器
显微镜
用于观察分离的线粒体和细胞核。
移液器
用于精确移取试剂和细胞样品。
离心机
用于高速离心，分离细胞的不同组分。
恒温培养箱
用于保持细胞培养的温度恒定。
实验对象（细胞来源）
小鼠胚胎成纤维细胞
这些细胞易于培养，并且含有丰富的线粒体和细胞核，适合 用于实验观察。
实验分析
通过实验结果分析，得出线粒体和细胞核在形态、大小、分布等方面 的特征与它们的功能密切相关。
对实验的理解与思考
实验意义
本实验对于理解细胞结构和功能 具有重要意义，特别是对于理解 线粒体和细胞核在能量代谢、基 因表达等方面的作用。
实验局限性
实验过程中可能存在一些误差和 干扰因素，例如组织匀浆不充分、 密度梯度离心条件不理想等。
实验一线粒体和细胞 核的制备与观察
contents
目录
• 实验目的 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论
01
实验目的
理解线粒体和细胞核的功能
线粒体功能
线粒体是细胞内的能量工厂，负责氧 化磷酸化，产生ATP，为细胞提供能 量。
细胞核功能
细胞核是遗传信息的储存和调控中心， 负责DNA的复制、转录和翻译，控制 细胞的生命活动。
细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究
细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究一、引言在细胞内，细胞核和线粒体是两个重要的细胞器。
细胞核是细胞中的控制中心，包含着细胞的遗传信息，可以指导细胞的生长、分裂、分化等重要生命活动。
线粒体则是能量产生的地方，参与了细胞内ATP的合成过程，是细胞内的“动力站”。
两者的正常功能和相互协调，对于维持正常细胞代谢和生命活动至关重要。
本文将介绍细胞核和线粒体在细胞内融合和分裂的分子机制研究。
二、细胞核的融合和分裂1. 细胞核的融合细胞核融合是细胞内一种常见的现象，发生在不同细胞类型之间，也可以发生在同一细胞内。
细胞核融合的主要过程是两个细胞核的膜和核孔融合，形成一个新的细胞核。
细胞核融合在细胞分裂、配子的合并以及体细胞复制等过程中发挥着重要的作用。
在真菌细胞的生殖过程中，细胞核融合是必须的。
在两个不同的菌株交配时，两个不同的细胞核先互相识别，然后相互融合。
细菌的细胞核融合是直接发生的，而真核生物的细胞核融合则需要依赖线粒体的参与。
2. 细胞核的分裂细胞核的分裂是指一个已经融合的细胞核经过有序的分裂过程分成两个细胞核，从而实现细胞的分裂。
细胞核分裂是生物体中一个基本的生物学过程，也是细胞分裂分化和生殖的基础。
细胞核的分裂可分为有丝分裂和无丝分裂两种。
有丝分裂的发生需要依赖于微管的形成和变化，在一系列有序的过程中完成细胞核的分裂。
相比之下，无丝分裂过程则较为简单，亦适用于一些不具有微管的原核生物。
三、线粒体的融合和分裂1. 线粒体的融合由于线粒体在基因组、膜蛋白结构等方面的特殊性质，线粒体细胞质的融合通常只发生在特定的条件下。
线粒体融合经常发生在精子的入侵和受精卵的形成过程中。
在精子进入受精卵之后，会释放出线粒体DNA，该DNA被研究人员用来推断线粒体融合的过程，进一步证实了线粒体融合的存在。
2. 线粒体的分裂线粒体分裂是通过不同的机制进行的，分别是原代线粒体的分裂和线粒体DNA的复制和分配。
酵母中线粒体的分裂过程需要多种催化反应，包括酵母基因群中的一组B电子转移酶蛋白和PARP-1和脑钠素的介导反应等。
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
细胞核及线粒体的分级分离实验报告下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。
2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。
二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。
对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。
在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。
从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。
细胞实验教案1.
细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。
二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
高中生物 实验二线粒体和细胞核的制备与观察
↓
↓
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沉淀（线粒体） 上清液（制一张涂片③后弃去）
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Байду номын сангаас
涂片方法示意图
4.4 分离物鉴定
▪ 细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定 液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏 水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40×） 检查。
▪ 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。 滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学 显微镜观察。
实验二 线粒体和细胞核 的制备与观察
1.实验目的
▪ 掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核 及线粒体的方法。
▪ 掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。
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2.实验原理
1）分级差速离心 ▪ 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度
取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离 心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不 同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使 这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。 ▪ 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核 糖体和大分子。 ▪ 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。
▪ 细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色 碎片。
▪ 线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
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口腔上皮生物细科学胞与教工的学程研系线究细室胞粒生物体学实分验 布
6.注意事项
▪ 分离全过程要在0～4℃进行，如果使用非 冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和 线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可 能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分 离过程不宜过长。
细胞组分分级分离实验报告
细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。
常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。
⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。
细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。
詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。
实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。
如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。
注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。
4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。
6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。
实验六细胞器的分离与观察
0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、
甲基绿
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-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离
（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹 部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组 织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。 匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的 蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相， 在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能， 保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
D 10000g x20min
E 105000g x120min
（2）离心：低温离心机中进行。 每次离心前 一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平。 第一次以600g离心10min。将其上清夜移入 Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待 后面使用(分离线粒体)。沉淀使用1ml预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次 1000g离心10min。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速
（r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。
离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离 心
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
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线虫细胞核和线粒体提取
N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。
初步计划收集10个皿线虫。
1.细胞核分离
细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。
查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。
方法如下：
1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合
2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。
吸出PBS。
3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。
转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。
4.以10000rpm短暂离心5-10秒。
5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中
6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次
7.用棉布过滤匀浆
8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。
丢弃上清液。
用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。
4℃ 600g 离心10分钟。
丢弃上清液。
10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。
在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。
11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。
12.翻转管子去除蔗糖。
从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。
核在这个阶段保留其膜。
要卸下膜，请执行步骤13。
13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。
在4℃下以600g离心10分钟。
重复该过程。
最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。
14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。
分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。
2.线粒体提取
查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下：
1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。
用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。
2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。
3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。
4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。
5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。
6.小心地清除上清液
7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。
细胞使用钝头针头和注射器进行破
碎。
注射器吹打溶胞产物。
重复10次。
或者使用Dounce或Potter匀浆器。
8.在4℃下将裂解物以1000x离心10分钟并小心将上清液转移到干净的1.5ml管中。
颗粒含有细胞核，细胞碎片和未破碎细胞。
如果需要，可以通过重复步骤7和8从细胞沉淀中再提取蛋白质使用500μl冰冷的破碎缓冲液。
每次提取的上清应在下一步之前混合。
9.离心步骤8的上清液以6000×g离心10分钟4℃。
10.小心取出上清液。
11.第10步沉淀重悬到750μl线粒体纯化缓冲液中，用1ml枪头吹打。
将750μl线粒体纯化缓冲液吸入2ml微量离心管并缓慢吸取在线粒体纯化缓冲液下500μl Disruption Buffer。
小心吸取在线粒体纯化缓冲层顶部的线粒体悬液。
12.在4℃下以14,000xg离心15分钟。
13.小心地除去1.5毫升的上清液，不要搅动线粒体层或颗粒。
14.小心地吸取线粒体层或颗粒至一个新的管子，留下0.5ml溶液在管底并。
15.用1.5ml线粒体储存液稀释步骤14的悬液，并在4℃下以8000xg离心10分钟。
16. 吸掉1.5毫升上清液，5毫升线粒体存储缓冲液稀释剩余物悬浮液，4℃下离心8000×g 10分钟。
17.重复步骤16，直到线粒体在底部形成颗粒的管子。
18.重悬线粒体沉淀在线粒体储存缓冲液中进一步分析。
分离的线粒体可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。