结构生物学NMR资料教程

强度为900mHz的Vrian公司的NMR波谱仪
3.2 NMR的基本原理
3.2.1 原子核的自旋与核磁共振
原子核的自旋量子数I
• I与原子核的质量数和原子序数有关
核自旋量子数I与质量数和原子序数的关系
质量数 原子序数
自旋量子数 I
奇数 偶数或奇数
半整数
偶数
偶数
0
偶数
奇数
1,2,3,…(非零整数)
hn0=g (h/2p) H0=DE
• 当外加一个与静磁场H0垂直的射频电磁场 H1，使其频率满足： hn=DE=hn0
时，低能态核吸收射频场能量而跃迁到高能态，于是
n=n0=gH0/2p 从以上公式可以看出：发生核磁共振的条件是：照射到自旋核上的电
磁波的频率（n）应等于自旋核的进动频率（n0），它不仅与核的特 性（g）有关，也与外磁场的强度（H0）有关。
NMR技术依赖于一个外加磁场和某些原子核中的天然“小磁铁”之间的 相互作用。
用NMR技术解析一个蛋白质的结构就象一件出色的侦探工作。
NMR使用的磁场
大多数强度范围在500mHz(11.7tesla)-800mHz(18.8tesla)之间。 NMR磁体是超导磁体 Vrian公司的NMR波谱仪（见图）
结构的精确性： 用均方根偏差（RMSD）来衡量 目前，多维NMR方法测定结构的精度可与分辨率为2-2.5Å的X 射线晶体结构相比较。
结构的正确性：
• 将蛋白质NMR结构与晶体结构相比较。 • 对NMR结构进行反计算，计算可能产生的NOE交叉峰，并与
NMR实验结果相对照。 • 近年来，发展了PROCHECK软件来判断NMR结构的正确性。
3.7 蛋白质折叠的NMR研究
蛋白质折叠是很迅速的过程 研究蛋白质折叠的意义 研究蛋白质折叠的方法 肌红蛋白的折叠研究：
The Sweetest Puzzle
"Getting a protein structure using NMR is a lot of fun," says Chele DeRider, a graduate student at the University of Wisconsin-Madison. "You're given all these pieces to a puzzle and you have to use a set of rules, common sense, and intuitive thinking to put the pieces together. And when you do, you have a protein structure." DeRider is working at UW-Madison's national NMR facility. She is refining the structure of brazzein, a small, sweet protein. Most sweet-tasting molecules are sugars, not proteins; so brazzein is quite unusual. It also has other remarkable properties that make it attractive as a sugar substitute. It is 2,000 times sweeter than table sugar —with many fewer calories. And, unlike aspartame (NutraSweet?), it stays sweet even after 2 hours at nearly boiling temperatures.
3.6 多维NMR方法测定蛋白质溶液三维结构的实 例----胰岛素的NMR结构研究
胰岛素生化性质：
胰岛素的晶体结构： 胰岛素的NMR结构：
B链羧端去七肽(B24～B30)胰岛素： 一种新晶型的结构
胰岛素,作为治疗糖尿病的制剂，其结构和功能已被进行了广泛的研究.胰岛素 存在缔合的问题.它可以缔合成二体、四体、六体甚至六体复合物.然而，在生 理条件下，在浓度为纳摩尔时，胰岛素将解聚成单体并发挥生理功能. 因此， 胰岛素六聚体解聚成单体的过程就成为人体吸收注射胰岛素的速控步.为了获 得速效而保持较高活性的胰岛素制剂，人们设计了许多突变体或类似物，并 对这些制剂的物理化学和生物化学特性进行了深入的研究.
• 在与H0相垂直的方向上再施加一个比H0弱很多的附加磁场H1（称为 射频场），当H1的频率与原子核的进动频率相同时，原子核从附加 磁场（射频场）吸收能量，产生自旋能级的跃迁。这就是核磁共振 （见图）。
核磁共振条件的理论推导
• 在外加静磁场H0的作用下，核自旋量子数不为零的原子核会发生能 级分裂。 以1H为例，其I=1/2，在静磁场H0中，它的进动可以有2I+1=2个 方向，即有2个能级，分别为顺磁场和逆磁场两种取向。如图所示。
而空间位置比较靠近的几个环可能成为比较柔性的活性部位。 这些具有不同结构特征的原子核间距、肽健二面角、肽链的动态特性等
都是多维NMR所要提取的蛋白质的结构信息。
3.4.2 核磁共振的波谱信息
直接用于测定蛋白质溶液三维结构的主要波谱参数为：
（1）化学位移：反映了空间结构及局域微环境的结构情况。 （2）J耦合常数：酰胺质子与a质子之间的耦合常数3JNa与主链
一位残基的a质子（1Ha）与后一位残基的酰胺质子在空间上相距甚远； 但是在b折叠中情况正相反。
a螺旋肽链上的每一亚氨基与前面第四位残基的羰基形成氢键，而反平 行b折叠的两条单链上相对的亚氨基与羰基之间形成氢键。
b折叠的肽键二面角f远大于a螺旋中的f。 三级结构中，几个b折叠相对集中的区域会形成一个比较刚性的疏水区，
可通过改变辐射电磁波的频率（扫频）或改变外加磁场的强度 （扫场）的办法来达到共振的目的。扫频在技术上有困难。 NMR谱仪都是保持射频振荡器的频率恒定，而连续改变H0的办 法达到共振的目的。见图。
3.2.4 化学位移
由电子云的屏蔽作用所引起的共振时磁场强度的移动，称为化学 位移。见图
化学位移与原子的核外电子云密度有关，后者又与原子核的化学 环境有关。因此，可根据化学位移的大小，来考察原子核所处的 化学环境，从而对化合物进行结构分析。
主链f角和侧链c’角的约束
3.5.2 获得蛋白质三维结构的不同构象集合
计算NMR三维结构的软件：DGII, Xplor, DIANA等。
具体计算蛋白质三维结构时，必须要获得一个蛋白质构象的集合， 包括40-50个蛋白质三维结构。
为什么要获得构象集合？
3.5.3 蛋白质NMR结构的精确性和正确性
X射线晶体学和NMR波谱学测定的最大结构的比较
NMR相对于晶体学的优点：
NMR使用溶液样品，因此，它不局限于那些能很好结晶的样品。 NMR可以测定不同溶液条件下的分子结构。 NMR也使得研究分子的性质相当容易，例如，研究分子的柔性、分子与
其它分子的反应或相互作用、分子的动态特征等。
NMR技术的原理简述
第三章 核磁共振波谱学
Nuclear magnetic resonance spectroscopy, (NMR)
3.1 简介
除X射线衍射以外，NMR技术是目前最普遍用于测定生物大分子空 间结构的技术。
NMR波谱学测定结构的方法比X射线晶体学方法年轻了20年。
1982年，确立了同核二维NMR谱测定蛋白质溶液构象的标准方法。 这一方法目前仍是一个发展的领域。
自旋耦合与自旋裂分可提供相互作用的核的数目、类型及相对位 置等结构方面的信息。
3.3 多维NMR
一维NMR谱是一个频率变量的函数：S(w) ，见图
二维NMR谱是两个频率变量的函数：S(w1,w2), 见图
二维NMR谱的原理 二维NMR谱中的对角线峰和交叉峰 不同类型的二维NMR波谱：二维分解谱、二维相关谱（COSY)、二维
• 由NOE导出的NOE距离约束 下限取1.8Å， 上限：强NOE，2.5-2.7Å, 中等NOE, 3.0-3.5Å，弱NOE, 5.0Å， 很弱NOE, 6.0Å
• 由氢键提供的距离约束 1HN与羰基氧的距离：2.3Å--1.8Å 亚氨基15N与羰基氧的距离：3.4Å--2.4Å
二面角约束文件
• I=0的原子核，如12C, 16O, 32S等，没有自旋，不产生核磁共振现 象。
• I≠0的原子核，具有自旋，可产生核磁共振现象。
• 结构生物学中，经常研究的原子核有：1H, 13C, 15N, 31P, 它们的自 旋量子数I=1/2。其中，1H核在生物分子中广泛存在，13C, 15N是 稀有同位素。
为了确定化学位移的大小，选一个参比核，规定其化学位移为零。 对于1H谱常以四甲基硅烷（TMS）为参比。参比核的屏蔽作用 很强，在最高场有一个强的尖峰，定义其化学位移为0，在其低 场区（左方）的化学位移为正值。化学位移的大小用下式计算：
d = (H参-H样)/H参 x 106 = (n样-n参)/n参 x 106 d的单位为ppm, 即10-6，大多数质子的d 在1-12之间。
多维谱包含了比一维谱丰富得多的信息。
实验方法灵活多样，可以设计出多种实验脉冲程序，从而产生各种有用 的多维NMR技术。
可以利用多维谱，间接地检测到在普通NMR谱中得不到的跃迁，如多量 子跃迁。
3.4 多维NMR确定蛋白质溶液三百度文库结构的基本原理
3.4.1 蛋白质的结构信息
不同二级结构提供了具有不同结构特征的原子间距离及肽键二面角。 a螺旋中，相邻两个残基的酰胺质子(1HN)在空间距离上很接近；而前
的二面角f有关，a质子与b质子之间的耦合常数3Jab与侧链二面角 c’有关。 （3）NOE（核欧沃豪斯效应）：NOE信号强度提供了蛋白质中 氢原子对之间的距离信息。
3.4.3 波谱信息与结构信息之间的对应
化学位移参数可用于判断蛋白质氨基酸序列中，a螺旋和b折叠等 二级结构单元的位置。 化学位移索引法（CSI）
影响化学位移的三种效应：
• 1) 磁各向异性效应：苯环p电子云的影响，使处于环上方和四周的氢 核的化学位移有极大的差别，见图。
• 2）顺磁效应：顺磁离子如Mn2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+的存在对周围核的 化学位移影响很大。
• 3）化学交换：与O, N, S 等原子相连的氢原子，在溶液中常常发生 质子交换。在pH值变化时，这类可交换氢的化学位移的变化非常大 （见图）。氢键的形成，使这种交换变慢，化学位移向低场变化。
3.2.2 弛豫
弛豫是高能态的自旋核释放能量返回低能态的过程。通过弛豫过 程可以获得稳定的核磁共振信号。
弛豫过程有两种：
• 自旋晶格弛豫，也称纵向弛豫。以弛豫时间T1表示。 • 自旋-自旋弛豫，也称横向弛豫。用弛豫时间T2描述。
3.2.3 吸收的测量
所有NMR波谱仪都采用测定与吸收有关的正信号。
3.2.5 谱线强度
在常规一维谱中，谱线强度与参与共振的粒子数成正比。（见图）
3.2.6 自旋耦合与自旋裂分
自旋核的核磁矩通过成键电子影响邻近核，引起其共振谱线增多， 这种现象称为自旋裂分，自旋核之间的相互作用称为自旋耦合。 见图。
裂分的共振谱线的能量差，称为自旋耦合常数，以J表示。J与分 子结构有关。
自旋回波相关谱（SECSY）、二维NOE谱（NOESY）。 NOESY谱---核欧沃豪斯效应波谱---反应的结构信息
三维NMR是三个频率变量的函数：S(w1,w2,w3), 四维NMR是四个频 率变量的函数：S(w1,w2,w3,w4)。见图。
多维NMR谱的特点：
多维谱可以把一维谱中的重叠峰在二维或三维方向展开，便于NMR谱的 解析。
b
DE
H0=0
a
H0>0 能级裂分图
顺磁场的1H核居较低能态，逆磁场的1H核居较高能态，二者能级差：
DE = g h H0 其中，g 为旋磁比，是各种核的特征常数，不同原子核的旋磁比不同。h = h/2p，
h 为普朗克常数。H0为外加静磁场的强度。 自旋核绕外磁场方向进动的频率为：
n0 = gH0/2p 以上两个方程合起来得：
J耦合常数可由Karplus方程直接推算出相应的主链和侧链的二面 角f和c’:
NOE信号可以导出质子间距离，这是计算蛋白质溶液三维结构的 最主要实验依据。
3.5 蛋白质溶液三维结构的计算
由核磁共振数据计算蛋白质溶液三维结构的流程图
3.5.1 建立核磁共振波谱数据的约束文件
距离约束文件：
NMR落后于X射线晶体学的方面：
目前NMR还只能测定小的和中等大小的蛋白质的结构。 NMR测定的最大结构：30-40kD （270-360氨基酸） X射线晶体学测定的最大结构：2500kD ------60倍大于前者（见图）
NMR谱图的识别要手工完成，耗时且易出错。目前还没有自动化的谱图 识别方法。
原子核的自旋与进动
• 原子核都具有电荷和质量，自旋量子数I≠0的原子核由于能够自旋 因而还具有自旋动量或角动量。旋转的电荷有磁场，有自旋的核就 有与角动量有关的磁矩。
• 在一个强大而均匀的外加磁场H0中，自旋核的磁矩将沿外磁场的方 向进行取向。自旋核将产生进动。（见图）
核磁共振的产生
• 原子核自旋轴在外加磁场H0中的取向是量子化的，每一个取向相当 于一个自旋能级。 H0的增加不能产生自旋能级的跃迁。