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研究内容
苏丹红I多抗 制备及鉴定
苏丹红I免疫学 检测方法建立
间接 竞争 ELISA 方法
胶体金 免疫层 析试纸 条法
1. 苏丹红I多克隆抗体的制备
苏丹红I 多抗 制备
苏丹红I衍生物-明胶免疫抗原的合成 苏丹红I多克隆抗体的制备 苏丹红I多克隆抗体的纯化及含量测定
1.1 苏丹红I免疫原的制备
免疫原的制备： ① 利用重氮法合成带有羧基的苏丹红I衍生物 ② 利用混合酸酐法合成苏丹红I-明胶复合物
酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹 红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，显色程 度与样品中苏丹红I含量成反比。
OD492 nm
1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
50
100
150
200
250
Fra Baidu bibliotek
300
苏丹红I标准抗原浓度（ng/mL）
根据待测样品的OD值，推算出样品中的苏丹红I的浓度。
对氨基苯甲酸 2-萘酚
苏丹红I衍生 物
苏丹红I衍生 物
明胶
苏丹红I衍生物-明 胶
2.3 苏丹红I多抗的制备
选择体重2 kg的雄性新西兰兔，按照常规免疫程序，制 备多克隆抗体。整个免疫过程为2～3个月。
首次免疫： 0.5 mL完全弗氏佐剂+ 0.5 mL 2 mg/mL免疫原, 于兔背部注射。 2 周 后: 0.5 mL不完全弗氏佐剂+ 0.5 mL 2 mg/mL免疫原，足掌注射。 每隔10天: 于兔耳缘静脉注射免疫抗原1.0mL，
加强免疫3次。 最后一次免疫后的7～10天试血。
2.4 多克隆抗体的纯化
辛酸硫酸铵法 亲和层析法
2.1 苏丹红I衍生物的合成结果
a- 苏丹红I b- 衍生物
苏丹红I衍生物红外图谱鉴定 b曲线在1700cm-1处存在较强的吸收峰表明
反应产物的结构上基本连接羰基。
2.2 苏丹红I衍生物的色谱分析结果
1.苏丹红I抗体效价的测定 2.苏丹红I抗体亲和力的测定 3.建立间接竞争ELISA检测方法 4.待测样品的前处理
2.1.1 苏丹红I抗体效价的测定
吸光度值（A492nm）
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
64 32 16
8
4
2
1
抗苏丹红I特异抗体性稀抗释体度(效×1价00测0-1)定
效价为1:32 000
抑制率=1200100 %-(OD1-OD阴性) /（OD2-OD阴性）×100 %，
其中，O0D1为竞1争孔的O2D值，OD3 2为不含4苏丹红I孔5的OD值。6
苏丹红I的浓度对数lg(ng/mL)
抗血清亲和性IC50：15.0 ng/mL， 最低 检 测 限 IC10 ：1.0 ng/mL。
2.1.3 间接竞争ELISA的建立
2. 经CA-AS纯化后，有3-4条较明显 的条带，血清经纯化后，大部分 杂蛋白被除去；
3. 经AC纯化后，有两条明显条带， 一条为重链，分子量约55KD，另 一条为轻链，分子量约14 KD，与 IgG抗体的重链和轻链的分子量较 符合，纯化后的抗体纯度较高。
M- 低分子量Maker； 1- 苏丹红I抗血清； 2- AC纯化抗体； 3- CA-AS纯化。
2.1.2 苏丹红I抗体亲和力的测定
本实验利用竞争ELISA法，测定抗体的亲和力。
若抗1体00 具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即
90
可产生80 50 70
%的抑制率，故常用IC50，即产生50
%
B/B0 (%)
抑制率60 时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性， 50
以10 34%00 抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限。
目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器（ HPLC 、IASHPLC ）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于： 1. 检测仪器昂贵 2. 检测成本高 3. 操作复杂 4. 耗时长 5. 需专业人员操作 6. 不适宜现场抽查及推广应用
免疫学检测技术解决食品中苏丹红I快速检测的问题！
一. 研究内容
2.3 苏丹红I免疫原的合成结果
苏丹红I免疫原紫外扫描结果
a曲线显示苏丹红I在500nm处有强的特征吸收峰； b曲线显示明胶在220nm处有强的特征吸收峰； c曲线同时具有苏丹红I和明胶的特征，表明苏丹 红I与明胶偶联成功。
2.4 SDS-PAGE测定IgG的纯度
1. 苏丹红I抗血清，有多条带，含有 较多杂蛋白；
2.1.4 待测样品的处理
称取2.0 g的空白辣椒粉样品，准确加入10 mL乙腈，均质2 min， 超声15 min。滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水，所得溶液用真空 旋转蒸发仪40℃旋转蒸干，甲醇-0.02mol/L PBS0.2 mL溶解残渣。
实际添加量 (μg/kg)
4.00 8.00 16.00 32. 0
0.1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
蛋白质浓度(mg/mL)
BCA法测定蛋白质浓度
浓度为1.93 mg/mL。
一. 研究内容
研究内容
苏丹红I多抗 制备及鉴定
苏丹红I免疫学 检测方法建立
间接 竞争 ELISA 方法
胶体金 免疫层 析试纸 条法
2.1 间接竞争ELISA方法的建立
研究 内容
2.5 特异性IgG的浓度测定
根据BCA法的标准曲线 0.6
y=0.5198x + 0.2464，
0.5
A(592 nm)
R2=0.9778，
0.4
0.3
计算得到:
0.2
y = 0.5198x + 0.2464 R2 = 0.9778
辛酸硫酸铵纯化的抗体 浓度为4.24 mg/mL， 亲和层析柱纯化的抗体
前言
苏丹红I（1-苯基偶氮-2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学 合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。
苏丹红I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和1-氨基-2-萘酚， 这些物质会攻击肝细胞，引起中毒性肝病，也可造成神经系统损害，是一 种遗传毒性致癌物。
苏丹红I
前言-苏丹红I检测现状
ELISA检测量 (μg/kg)
3.81 6.87 15.65 30.56
加标回收率 （%）
95.25 85.88 97.83 95.50
变异系数 (n=3)/ (%)
6.6 4.9 7.4 6.2
实验结果测得辣椒粉中苏丹红I的加标回收率为85.88%- 97.83%
2.1.5 交叉反应率测定
用建立的间接竞争ELISA法测定苏丹红其他染料， 计算苏丹红I抗体的交叉反应率。
苏丹红I多抗 制备及鉴定
苏丹红I免疫学 检测方法建立
间接 竞争 ELISA 方法
胶体金 免疫层 析试纸 条法
1. 苏丹红I多克隆抗体的制备
苏丹红I 多抗 制备
苏丹红I衍生物-明胶免疫抗原的合成 苏丹红I多克隆抗体的制备 苏丹红I多克隆抗体的纯化及含量测定
1.1 苏丹红I免疫原的制备
免疫原的制备： ① 利用重氮法合成带有羧基的苏丹红I衍生物 ② 利用混合酸酐法合成苏丹红I-明胶复合物
酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹 红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，显色程 度与样品中苏丹红I含量成反比。
OD492 nm
1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
50
100
150
200
250
Fra Baidu bibliotek
300
苏丹红I标准抗原浓度（ng/mL）
根据待测样品的OD值，推算出样品中的苏丹红I的浓度。
对氨基苯甲酸 2-萘酚
苏丹红I衍生 物
苏丹红I衍生 物
明胶
苏丹红I衍生物-明 胶
2.3 苏丹红I多抗的制备
选择体重2 kg的雄性新西兰兔，按照常规免疫程序，制 备多克隆抗体。整个免疫过程为2～3个月。
首次免疫： 0.5 mL完全弗氏佐剂+ 0.5 mL 2 mg/mL免疫原, 于兔背部注射。 2 周 后: 0.5 mL不完全弗氏佐剂+ 0.5 mL 2 mg/mL免疫原，足掌注射。 每隔10天: 于兔耳缘静脉注射免疫抗原1.0mL，
加强免疫3次。 最后一次免疫后的7～10天试血。
2.4 多克隆抗体的纯化
辛酸硫酸铵法 亲和层析法
2.1 苏丹红I衍生物的合成结果
a- 苏丹红I b- 衍生物
苏丹红I衍生物红外图谱鉴定 b曲线在1700cm-1处存在较强的吸收峰表明
反应产物的结构上基本连接羰基。
2.2 苏丹红I衍生物的色谱分析结果
1.苏丹红I抗体效价的测定 2.苏丹红I抗体亲和力的测定 3.建立间接竞争ELISA检测方法 4.待测样品的前处理
2.1.1 苏丹红I抗体效价的测定
吸光度值（A492nm）
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
64 32 16
8
4
2
1
抗苏丹红I特异抗体性稀抗释体度(效×1价00测0-1)定
效价为1:32 000
抑制率=1200100 %-(OD1-OD阴性) /（OD2-OD阴性）×100 %，
其中，O0D1为竞1争孔的O2D值，OD3 2为不含4苏丹红I孔5的OD值。6
苏丹红I的浓度对数lg(ng/mL)
抗血清亲和性IC50：15.0 ng/mL， 最低 检 测 限 IC10 ：1.0 ng/mL。
2.1.3 间接竞争ELISA的建立
2. 经CA-AS纯化后，有3-4条较明显 的条带，血清经纯化后，大部分 杂蛋白被除去；
3. 经AC纯化后，有两条明显条带， 一条为重链，分子量约55KD，另 一条为轻链，分子量约14 KD，与 IgG抗体的重链和轻链的分子量较 符合，纯化后的抗体纯度较高。
M- 低分子量Maker； 1- 苏丹红I抗血清； 2- AC纯化抗体； 3- CA-AS纯化。
2.1.2 苏丹红I抗体亲和力的测定
本实验利用竞争ELISA法，测定抗体的亲和力。
若抗1体00 具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即
90
可产生80 50 70
%的抑制率，故常用IC50，即产生50
%
B/B0 (%)
抑制率60 时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性， 50
以10 34%00 抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限。
目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器（ HPLC 、IASHPLC ）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于： 1. 检测仪器昂贵 2. 检测成本高 3. 操作复杂 4. 耗时长 5. 需专业人员操作 6. 不适宜现场抽查及推广应用
免疫学检测技术解决食品中苏丹红I快速检测的问题！
一. 研究内容
2.3 苏丹红I免疫原的合成结果
苏丹红I免疫原紫外扫描结果
a曲线显示苏丹红I在500nm处有强的特征吸收峰； b曲线显示明胶在220nm处有强的特征吸收峰； c曲线同时具有苏丹红I和明胶的特征，表明苏丹 红I与明胶偶联成功。
2.4 SDS-PAGE测定IgG的纯度
1. 苏丹红I抗血清，有多条带，含有 较多杂蛋白；
2.1.4 待测样品的处理
称取2.0 g的空白辣椒粉样品，准确加入10 mL乙腈，均质2 min， 超声15 min。滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水，所得溶液用真空 旋转蒸发仪40℃旋转蒸干，甲醇-0.02mol/L PBS0.2 mL溶解残渣。
实际添加量 (μg/kg)
4.00 8.00 16.00 32. 0
0.1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
蛋白质浓度(mg/mL)
BCA法测定蛋白质浓度
浓度为1.93 mg/mL。
一. 研究内容
研究内容
苏丹红I多抗 制备及鉴定
苏丹红I免疫学 检测方法建立
间接 竞争 ELISA 方法
胶体金 免疫层 析试纸 条法
2.1 间接竞争ELISA方法的建立
研究 内容
2.5 特异性IgG的浓度测定
根据BCA法的标准曲线 0.6
y=0.5198x + 0.2464，
0.5
A(592 nm)
R2=0.9778，
0.4
0.3
计算得到:
0.2
y = 0.5198x + 0.2464 R2 = 0.9778
辛酸硫酸铵纯化的抗体 浓度为4.24 mg/mL， 亲和层析柱纯化的抗体
前言
苏丹红I（1-苯基偶氮-2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学 合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。
苏丹红I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和1-氨基-2-萘酚， 这些物质会攻击肝细胞，引起中毒性肝病，也可造成神经系统损害，是一 种遗传毒性致癌物。
苏丹红I
前言-苏丹红I检测现状
ELISA检测量 (μg/kg)
3.81 6.87 15.65 30.56
加标回收率 （%）
95.25 85.88 97.83 95.50
变异系数 (n=3)/ (%)
6.6 4.9 7.4 6.2
实验结果测得辣椒粉中苏丹红I的加标回收率为85.88%- 97.83%
2.1.5 交叉反应率测定
用建立的间接竞争ELISA法测定苏丹红其他染料， 计算苏丹红I抗体的交叉反应率。