圆二色谱资料

圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。

一．简介

圆二色谱是用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱。光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圆二色性。如果以不同波长的平面偏振光的波长λ为横坐标，以吸收系数之差Δε=εL-εR为纵坐标作图，得到的图谱即是圆二色光谱，简称CD。如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε。圆二色谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。由于△ε有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。

二．样品要求

1、样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂

必须在测定波长没有吸收干扰;样品能完全溶解在溶剂中, 形成均一透明的溶液。

2、氮气流量的控制

3、缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系。

4样品浓度与池子选择

样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小(光径)的选择和浓度的要求也不一样。蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行。

三．谱带宽度

选为1 nm。对于高分辨率测量，要用较窄的狭缝宽度，此时光电倍增管的电压较高，谱的信噪比差。虽然对于正常测量最佳谱带宽度是1~2 nm，但是在下列情况下要牺牲分辨率而需要较宽的狭缝宽度。当样品的吸光度很高但CD信号很弱时，一方面要尽量保证测定CD峰所需要的足够浓度，另一方面要设置较宽的狭缝。不过此时要特别小心，因为样品在吸光度过高(A>2)的情况下可能存在荧光或杂散光引起的某些假象。另外，在固体CD光谱测试时也需要较大的狭缝宽度(一般要求> 2 nm)。

(2)椭圆率和摩尔椭圆率都依赖于测量条件。因此，温度、

波长和样品浓度总是应该特别注明的。

(3) 当用压片法或石蜡油研磨法进行固体粉末样品测试时，要尽可能地研磨获得细小均匀的样品颗粒。采用石蜡油糊方法时，必须注意某些憎水有机化合物可能溶于石蜡油中，这时所得CD光谱在某种意义上应视为溶液CD光谱。采用压片法测试固体CD时，在保证手性样品的定性浓度达到CD光谱仪检测要求的同时，片越薄越透明越好(但切忌破损)。在某些情况下，压片法不适用于手性抗衡阴离子存在下的固体诱导CD光谱的测定。

使用压片机须注意：

①FW-4型压片机极限压力24吨，对应压力表读数

37.5 MP，超过此极限容易损坏机器，请不要随意加压。

②一般用途的压片，加压至8吨(12.5 MP)即可，当KBr(或KCl)用量约50 mg时能获得较光滑均匀的片膜。

③使用压片机时如感觉压油手柄有压力，而压力表读数为0，请立即旋松油阀，检查压力表是否损坏。

④机器放置一段时间未使用，在使用前可旋紧放油阀，加压至15 MP，再旋松放油阀。如此反复几次，即可正常使用。

⑤压片完成后，请用棉花蘸取少量酒精将压片模具和研钵洗干净，置于红外灯下烘干后再将压片模具放回干燥器中。压片剩余的固体粉末和使用过的棉花倒入垃圾桶中。

(4) 在紫外区进行光谱扫描时，J-810型CD光谱仪的耗氮量为：3 L/min(190~400 nm)；3~5 L /min(185 nm)；10 L/min(180 nm)；30~50 L/min(175 nm)；60~70 L/min(170 nm)。因此当测定蛋白等样品的远紫外光谱时，必须增加氮气的流量，以避免臭氧对紫外光产生的吸收干扰光谱的测定。

(5) 对获取理想的溶液或固体CD谱图的建议：

①手性样品符合CD光谱测试的条件(在给定波长范围内有较强的CD信号和合适的吸收值)。必须事先测定手性样品的UV-Vis吸收光谱(溶液或固体漫反射)，预测CD谱峰的可能位置和选择合适的制样浓度(对于溶液吸收光谱，A ≈1)。

②提供高对映纯度的手性样品。

③根据样品的性质选择测定方式(溶液、固体、单晶或荧光CD)。

④对溶液样品应选用合适的溶剂(见附表)、浓度和光程(与测定UV-Vis光谱类似)。对于在紫外区测试的样品建议选用较小的光程(≤0.5 cm)和截止波长足够低的溶剂，最好为高纯水或醇类溶剂(见附表)。

⑤对固体样品的压片法测试，应视样品的不同选用合适百分比浓度及合适的稀释剂( KBr、KCl或CsI 等)研磨压片后进行透射扫描。

⑥选择适当的测定参数(波长范围、扫描速度、灵

敏度和狭缝等)。

⑦对于同一个样品，在可能的条件下，建议同时做其溶液和固体CD光谱加以比较。

⑧如果可能，最好同时做一对对映体的CD光谱，以检查其CD信号的真伪和在定量的条件下互相印证其对映纯度。

三．原理

光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。其电场矢量E 与磁场矢量H 相互垂直，且与光波传播方向垂直。由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面。平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光。其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光。两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅(强度) 不相同,则合成的将是一束椭圆偏振光。

光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( =AL -AR) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism ,简写作CD) 。圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光,且只在发生吸收的波长处才