第二章 基因工程工具酶
基因工程-2-工具酶
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
2第二章 基因工程工具酶
DNA连接酶
作用模式图： 1. 连接粘性末端
5′
3′
*********G —OH *********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P— A A T T C********* OH— G*********
3′
5′
DNA连接酶
5′ **********GAATTC**********
目录
用途： ①连接带匹配粘端的DNA分子。 ②使平端的双链DNA分子互相连接或与合成
接头相连接。
三 核酸酶S1
功能： 水解双链DNA、RNA或DNA-RNA
杂交体中的单链部分。
核酸酶S1
核酸酶S1
+
核酸酶S1
用途：
1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端；
2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构；
（3）特点： 星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧 的碱基没有特异性。
GACTAGCNAATTNTACGCAATTT CTGATCGNTTAANATGCGTTAAA
EcoRI*
EcoRI*
（4）产生的原因 a.高甘油含量（>5%V/V) b.内切酶用量过大，一般为> 100U/g DNA c.低离子强度<25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在
9 Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通 用缓冲液)的使用表
二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接
DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3′-OH和 5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单 链断裂形成的缺口连接起来。
基因工程常用的工具酶
四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
第二节 基因工程工具酶
第二节 基因工程工具酶【掌握常用工具酶的定义、特点、作用方式】我们大家都知道，基因工程是现代生物技术的核心技术，带动其他技术的发展。
基因工程的基本技术就是：切接 转 增 检用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。
在进行这些操作时，需要借助一类特殊的工具【如同做外科手术需要手术刀这种工具一样】，在基因工程操作中这种必不可少的工具就是——酶；由于这些酶类被用作工具，所以称之为“工具酶”。
这些酶种类繁多，作用、特点各异，到目前为止，常用的工具酶有300多种。
下面着重讲解一些重要的工具酶。
一、限制性核酸内切酶● 定义：是一类能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
● 生理功能特性：切割降解入侵的外源DNA ，使得外源DNA 的入侵受到限制的现象。
（一）命名EcoR Ⅰ(E ：属名；co ：种名；R ：细菌株RY13的第一个字母；Ⅰ：发现次序)Eco Escherichia属名 Coli 种名 Ry13 株系编号（三）基本特性1、识别特定序列✧绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
✧识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。
2、切割方式：由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：（1）产生平末端在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成平头双链末端，称为平整末端。
【书上p15图】（2）产生粘性末端限制性内切酶交错切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，可形成氢键，叫做~。
5’粘性末端【书上】3’粘性末端它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
基因工程的工具酶
第二章基因工程的酶学基础内容一、概述二、限制性内切核酸酶三、DNA连接酶四、其他工具酶一、概述工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
工具酶名称主要功能限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5’-OH末端上(接下表格)工具酶名称主要功能反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团BAP orCIAP核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链工具酶名称主要功能核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase二、限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶的分类2、限制性核酸内切酶的命名原则3、限制性核酸内切酶的基本特征4、影响限制性内切酶的活性因素5、限制性核酸内切酶的应用1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶主要分成三大类：I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
第2章 基因工程工具酶
2.DNA纯度
限制核酸内切酶酶解DNA的效率很大程上取决于DNA 本身的纯度。 纯度较差的DNA在正常的酶切时可做如下补救：
①加大酶的用量：每微克DNA基质由1单位提高到5－10倍。
10U/µgDNA
② 扩大反应体积：以让污染物相应得到稀释。 ③ 延长酶解的反应时间，但DNase污染不能用此法。
A B N B’ A’ A’ B’ N B A 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形 式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。
断裂类型: DNA被限制性内切酶切 开之后，呈现两种断裂类型
切割方式：按切割位点相对于二重对称轴的 位置来区分 (1)平头末端(blunt ends ) ：如Pvu II, Alu I, EcoR V 切割方式是在对称轴处切割 ，就产生平末端
④ 如RNA过多可在反应体系中加入适量的RNase.
3.甲基的影响
两种甲基化酶-- dam 和dcm
Dam：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化，腺嘌 呤N6位置上引入甲基; Dcm：催化CCA/TGG序列中内部胞嘧啶残基甲基化。 限制性内切酶如BglI对dam甲基化酶发生甲基化作 用的DNA很敏感，对即使纯度再高的这种DNA也很难 用什么办法酶切完全。 但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失 去活性。
同）
同尾酶：酶切后产生的DNA粘性末端相同的 一类限制酶。 （识别位点序列不一定相同） BamHI, BclI,Bgl Ⅱ ,Sau3AI,XhoⅡ是一 组同尾酶
杂种位点（hybrid site)：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。 杂种位点一般不能再被原来的任何一种同尾酶 所识别。
第二章 基因工程工具酶
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
《基因工程》第二章工具酶
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
PPT文档演模板
•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
基因工程第二章 基因工程工具酶
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
2 基因工程的工具酶
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 3 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
在限制修饰系统中，限制作用是指一定类 型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用， 破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得 外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基 化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化 ，可免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性 内切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的保 护机制。
5’
PvuⅡ 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
3’ … C-G-A-G-T-C-P 3‘
P-C-T-G-G-A-G OH-G-A-C-C-T-C
…
… 5’
星号活性（star activity） 又称星活性，一些限制性内切酶在某 些反应条件变化时酶的专一性发生改变 ，如酶浓度过高、反应液离子强度过低 、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶 切割位点专一性发生改变。
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ BclⅠ
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生 相同的5’GATC粘性末端，由这种 同尾酶产生的DNA片段可因粘性末 端的互补而彼此再连接起来。
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’ BglⅡ
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
P OH
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第二章基因工程工具酶
第—节限制性核酸内切酶
第二节DNA连接酶
第三节DNA聚合酶
第四节末端脱氧核苷酸转移酶
第五节核酸酶
第六节核酸外切酶
第七节碱性磷酸酶
第八节T4噬菌体多核苷酸激酶
第—节限制性核酸内切酶
1、宿主的限制和修饰现象
2、限制性核酸内切酶的类型
3、限制性核酸内切酶的命名
4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、
8bp的
4.2 识别序列结构：回文对称
4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶
4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能
4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割
4.6 星号活性(star activity)
（1）星活性产生的原因
（2）抑制星星活性的条件(措施)
5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应
5.1 标准酶解体系的建立
5.2 酶切反应的基本步骤
5.3 终止反应常用方法：
（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它
5.4 多酶联合酶解策略：
（1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切
（2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法
5.5 DNA分子酶切常用缓冲液
5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解
5.7 内切酶酶解反应中的注意事项
6、影响限制性核酸内切酶活性的因素
6.1. DNA的纯度
6.2 DNA的甲基化程度
6.3 酶切消化反应温度
6.4 缓冲液(Buffer)
6.5 DNA分子的构型
6.6 反应时间
6.7 酶量使用
第二节DNA连接酶
1、DNA连接酶的发现
2、概念及其特点
3、DNA连接酶的种类
▪大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。
▪T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。
▪T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。
4、DNA连接酶的反应体系
5、影响连接反应的因素
5.1 DNA末端的浓度
5.2 反应温度
5.3 ATP浓度
6 、DNA连接的策略
6.1 粘性末端DNA片段的连接
6.2 平末端DNA片段的末端连接法
▪ 6.2.1 常规连接
▪ 6.2.2 平末端DNA片段加接头连接法
▪ 6.2.3 平末端DNA片段的末端加尾连接法
6.3 防止自连--载体去磷酸化。