多酚氧化酶活性测定(免费)
多酚氧化酶活性测定及控制[文献综述]
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毕业论文文献综述生物工程多酚氧化酶活性测定及控制1 前言多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。
本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。
多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。
鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。
抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。
一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。
本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。
2 主题部分2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例）2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。
适合需大量制样时使用）将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。
C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。
称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。
【1】2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。
向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。
【2】2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）（1）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。
多酚氧化酶的活性测定的报告
朴东日：多酚氧化酶活性的测定。
一、试验目的本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。
二、试验原理酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
三、试验材料、试剂及试验用品材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。
药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）四、实验方法：1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。
2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。
将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。
以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。
3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。
(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。
4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。
2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书
多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系本公司工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体100mL×1瓶4℃保存粉剂粉剂×1瓶4℃保存试剂一液体20mL×1瓶4℃保存试剂二液体5mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。
产品说明：PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一200200试剂二5050样本50煮沸的样本5037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。
充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。
多酚氧化酶(PPO)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC0190规格：50T/24S产品简介：PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在410nm有特征光吸收。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存，用前混匀；试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。
操作步骤：一、粗酶液提取：1.收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2.称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
二、测定操作表：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一600600试剂二150150样本150煮沸的样本15037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。
冷却后，5000g，常温离心10min，收集上清，用蒸馏水调零，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。
注意:每个测定管需要设置一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5 min沸水浴处理。
PPO活性计算：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物、菌类和动物体内的酶，主要催化化学反应为将多酚氧化成醛或酮。
本实验旨在通过测定PPO的活性来了解酶的基本特性及其酶学性质。
一、实验材料1、经过离心沉淀的香蕉、苹果、洋葱原汁。
2、6%聚乙烯醇（PVA）溶液。
3、明胶溶液（1%）。
4、酚酞指示剂。
5、75mM bicine缓冲液（pH 8.5）。
6、0.05% 过氧化氢溶液。
7、1% 多巴胺溶液。
8、分光光度计。
二、实验原理多酚氧化酶是一种铜单子酶，催化剂的过程时首先将基质中的酚乙酸类化合物与氧气反应形成间醌，然后间醌的氧化、聚合，形成花青素、黑色素等产物。
本实验采用的基质是多巴胺（L-dopa），媒介是酚酞指示剂，测定体系的光学吸收度。
酶的活性按单位时间内反应的基质质量而计算。
三、实验步骤1、提取PPO将香蕉、苹果、洋葱各取50g，切碎，加入200ml 0.1M盐酸溶液，搅拌后放在4℃冷库20-30min，滤去上清液。
将残渣加入100ml冷水，搅拌，离心至沉淀物无明显色泽，取上清液后pH调节至8.5，保存于冷库。
2、测定PPO的活性（1）制备基质溶液：10mg多巴胺溶于2ml 0.1M的硫酸钠溶液中，用1M的NaOH溶液调节pH至8.5，加入12ml0.75M缓冲液，加水至50ml。
（2）制备酚酞指示剂溶液：2mg的酚酞溶于100ml的乙醇中，加水至1L，制成0.2%的酚酞溶液。
（3）测定反应系统：将基质溶液、酚酞指示剂溶液和一定量提取液混合，在25℃下恒温反应5min。
（4）实验对照：在上述条件下，仅加入基质溶液和酚酞指示剂溶液，无提取液作为实验对照。
（5）催化反应停止：加入0.5ml 的聚乙烯醇溶液。
（6）光度计测量：在650nm处上述反应体系产生的色素的吸光度。
4、结果计算将吸收度计算为1cm光程曲线的峰高比，用表格法计算多酚氧化酶活性反应速率以μmol/min为单位。
多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]
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毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。
本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。
二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。
在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。
同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。
2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。
面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。
2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。
2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。
2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。
抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。
2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。
多酚氧化酶活性的测定
多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶(POD)是一种酶类，广泛存在于植物、细菌和真菌等生物体中，具有氧化多酚的功能，可将多酚类物质氧化为其对应的醛酮或烯醇。
多酚氧化酶活性的测定是研究植物生理生态、农业及食品科学等领域的重要技术手段之一。
多酚氧化酶活性的测定方法有多种，常见的测定方法有单宁酸、苯胺、硫脲、芳香胺等底物的光度法、荧光法、色谱法和电化学法等。
其中，光度法测定多酚氧化酶活性是相对最简便、经济、有效的方法之一。
一、实验原理多酚氧化酶活性的测定原理基于多酚类物质的氧化反应，其反应方程式如下：多酚+ H2O2 → 多酚氧化酶→ 合成物 + H2O在光度法中，用苯酚为底物，通过苯酚酸化后生成背景吸光度，再将多酚加到反应体系中，多酚在酸性条件下与过氧化氢发生氧化反应，产生黄色的产物苯醛，可在310nm处检测吸光度增加。
二、实验步骤步骤一：制备反应液(1)苯酚称取1g苯酚溶于50ml0.1mol/L的钠碳酸中，加入2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至显红色终点，记录滴定体积，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至淡粉色的时间，同时记录滴定体积，测定得到苯酚的浓度。
(2)过氧化氢称取30%的过氧化氢溶液，在室温下稀释成0.04%过氧化氢溶液。
(3)缓冲液将0.2mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(PH 6.0)浓度稀释成0.05mol/L。
(4)酶提取液在质量浓度等于1的0.05mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液中先加入1mmol/L的PEG6000，频繁将其混合均匀之后，再加入5%聚乙烯醇，在最后再加入一些几丁糖粉，并不断地搅拌混合均匀之后过滤清除残留物，提取所需酶液。
(1)标准液分别取0-40μmol/L的马尾松酚，加入0.1mol/L的硫酸调节pH至1，在0.1mol/L的缓冲液溶液中进行100μl反应，80℃下控制反应时间在5min在323nm检测吸光度，绘制标准曲线。
(2)样品处理将植物或细胞样品在工作台上用0.1mol/L的N/2 H2SO4溶解，然后过滤，用样品液稀释1倍。
多酚氧化酶(PPO)检测
多酚氧化酶（PPO）检测
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO），又称为儿茶酚氧化酶，是一类含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
多酚氧化酶在茶中的主要作用是催化儿茶素形成邻醍，进一步形成茶黄素等色素物质和香气成分等。
PPO的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse）和漆酶（laccase），现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测多酚氧化酶的活性变化。
此外，我们还提供其他氧化应激类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定多酚氧化酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 多酚氧化酶含量/活性信息。
多酚氧化酶活性的测定
三、实验材料、仪器与试剂 1.材料：马铃薯； 2.仪器：恒温水浴、分光光度计、试管等； 3.试剂： 0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬 酸缓冲液（PH6.0）。
四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g， 用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至 100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定： （1）对照：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预 热后加入1mL灭酶后的酶液，2mL蒸馏水，以此调零。 （2）样品测定：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬 酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴 中预热后加入1mL酶液， 2mL蒸馏水，反应5分钟，加热灭酶 以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在 410nm下测定吸光度。
五、实验结果记录及分析： 以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位 （u）
A V 410 T 多酚氧化酶活性 [ u /g （ m ） in ] W V 0 . 01 t S
式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min，本次实验为5min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。
实验五 多酚氧化酶活性的测定
Hale Waihona Puke 一、实验目的：通过实验掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解 诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。
二、原理与方法 多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验 是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌， 在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD 值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶活性测定
实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的经过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在 525nm 波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式以下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2——————→邻醌＋ H2O三、资料、仪器及试剂1.资料：马铃薯块茎等2.仪器：UV－1206 或UV－1240 分光光度计；离心计；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3.试剂：聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）； 0.01mol ·L－1pH 6.5 磷酸缓冲液； 0.1mmol·L－1－1pH6.5 磷酸缓冲液； 0.05mol LpH5·.5 磷酸缓冲液； 30%饱和度硫酸铵； 0.1－1mol ·L儿茶酚；20％三氯乙酸。
四、实验步骤1.粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g 于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（早先用蒸馏水浸洗，尔后过滤以除去杂质）和100ml0.1mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液 ,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除积淀，上清液再加硫酸铵使达 60％饱和度，离心收集积淀。
将所得积淀溶于2～3ml0.01mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2.活性酶的测定在试管中加入 3.9ml 0.05 mol L－·1pH5.5 磷酸缓冲液， 1.0ml 0.1 mol L －·1 儿茶酚在 37℃恒温水浴中保温 10min，尔后加入 0.5ml 酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于 525nm 波长处以时间扫描方式，在 1～2min 内测定吸光度变化（ A）值。
五、酶活性的计算以每 min 内 A525 值变化 0.01 为 1 个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法，但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20°C 下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚- --- & 邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIQ+5KI+6HO H6KCI+3HO+3I23b+3Vb3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2 邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2 克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2 天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2. 0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIQ （预先在102C烘2小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1 升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIQ和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3. pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定(精)
六、思考题
1.多酚氧化酶活性测定实验中计算多酚氧化酶活性
时为什么要减去抗坏血酸氧化酶活性？
2.测定多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性时加入偏
磷酸的作用是什么？
抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1
酶溶液 2 2 2 2 2 2
偏磷酸 (保温一定时间后) 1 1 1 1 1 1
五、试验结果
(1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算： 抗坏血酸氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重· 分)] =[ V′-( V 1- V 2)] ×0.44 (V/a)/(w×a) 式中：V′=滴定3号空白所用去的碘液毫升数； V1=滴定1号瓶所用去的碘液毫升数； V2=滴定2号瓶所用去的碘液毫升数； 0.44=每毫升5/6mmol碘液氧化抗坏血酸毫克数； V=提取液总体积（ml）； a=测定时所用提取液的ml数 w＝样品鲜重(g) t＝测定时间(分)。
利用单位时间内单位植物材料抗坏血酸的氧化量 利 用 间接表示多酚氧化酶的活性：
多酚氧化酶
儿茶酚＋O2
儿茶醌＋H2O
儿茶醌+抗坏血酸→儿茶酚＋脱氢抗坏血酸
三、实验材料
梨果肉
四、实验步骤
1．酶液提取 2．酶活性的测定（按下表配制反应体系）
瓶 号 1 2 3 4 5 6
缓冲液 4 4 4 3 3 3
+
1 2
抗坏血酸氧化酶
O2
O O H
C C C C H O
+
H2O
H
HO
C
C H
HO
CH2OH
抗坏血酸
CH2OH
脱氢抗坏血酸
利用碘液滴定剩余抗坏血酸
O
C HO HO H HO C C C C H O + C O C C C C H O O
多酚氧化酶的测定
多酚氧化酶的测定试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。
2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。
3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。
4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。
贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。
贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。
在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。
2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。
然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。
最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定作者:《果蔬贮藏加工学实来源:华南农大浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40 验指导》植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定一、原理抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶可催化空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。
因此，在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦儿茶酚，可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。
抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。
碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘，放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。
二、材料与设备材料：马铃薯块茎设备：水浴锅、台秤、离心机试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙酸、1％淀粉。
0.05mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾12.5ml，定容至250ml。
三、试验步骤（一）酶液制备：称取马铃薯块茎10.0g，用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml，在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备用。
（二）酶活性测定：１. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐│瓶号│ 蒸馏水│0.1％抗坏血酸│0.02mol/L焦儿茶酚│ 酶│煮5分钟酶│├──┼────┼───────┼─────────┼──┼─────┤│ 1 │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 1' │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 2 │ 4 │ 2 │ │ │ 2 ││ 3 │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 3' │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 4 │ 3 │ 2 │ 1 │ │ 2 │└──┴────┴───────┴─────────┴──┴─────┘1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸1ml，摇匀，终止酶反应。
邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性试剂配制(1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。
(3)0．5N盐酸。
(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5NHCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。
(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。
标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。
定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。
以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
2。
投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。
取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。
最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。
比色时用波长为430nm的滤光片。
为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。
为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。
在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。
3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。
多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。
我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。
我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。
将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。
酶活测定方法.doc
酶活测定方法.doc二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。
二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。
因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。
（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。
（三）试剂1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。
3．50 mmol/L邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。
四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
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末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端， 末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端， 把电子传递给O 的酶。 把电子传递给 2的酶。 1、细胞色素氧化酶 、 2、交替氧化酶 、 3、酚氧化酶 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 多酚氧化酶。 、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶 4、乙醇酸氧化酶 、 5、抗坏血酸氧化酶 、
五、实验报告： 实验报告： 计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数 活性。选择 值变化均匀的三组数 计算所测材料的 活性 值求平均值。 值求平均值。
一、实验目的： 实验目的： 掌握测定多酚氧化酶活性的方法； 掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性 实验原理： 二、实验原理： 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶， 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化 生成醌。醌有颜色， 下有最大光吸收， 生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光 下有最大光吸收 度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。 度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。 三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 、仪器：低温离心机、 分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 、试剂：儿茶酚、 磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯 、材料：
四、实验步骤： 实验步骤： 1．称取马铃薯 克，加入 磷酸缓冲液， ．称取马铃薯0.5克 加入L pH 7.2磷酸缓冲液，少许 磷酸缓冲液 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用 ，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓 磷酸缓 冲液冲洗研钵，合并提取液。 ℃ 离心15分钟 冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 5000rpm离心 分钟，上 离心 分钟， 清液即为粗酶液。 清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入 磷酸缓冲液， ．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚 磷酸缓冲液 以及1mL 粗酶液，空白调零以 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 磷酸缓冲液代替粗酶液。 以及 磷酸缓冲液代替粗酶液 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于 值测定： ． 值测定 加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定 下测定 反应体系的A值 每隔30秒记录一次 共记录5次 秒记录一次， 反应体系的 值，每隔 秒记录一次，共记录 次。 4．计算酶活力。按下式计算 ．计算酶活力。 PPO活性＝U/min gFW 活性＝ 活性 A值增加 值增加0.001定义为一个酶活力单位。 定义为一个酶活力单位。 值增加 定义为一个酶活力单位