Betaine and DMSO- Enhancing Agents for PCR
脆性X染色体综合征的临床检测方法研究
脆性X染色体综合征的临床检测方法研究魏婷婷;周东蕊;张红琳;付文忠;张仁敏;杜彩贺;胡芳【摘要】目的是建立一种简便、快捷的脆性X染色体综合征的临床检测方法.在常规PCR的基础上,采用热启动法,同时加入PCR增强剂Btaine、DMSO,对20例表型正常人群外周血样本进行FMR1基因(CGG)n重复序列检测.结果表明,改良后的FMR1基因PCR扩增技术能够高效扩增CG富集区,采用该方法我们检测了20例外周血样本均获得目标片段,PCR扩增产物片段长度400～500bp(相当于n=20～53).因此,该方法简便、快速、经济而且重复性好,可用于群体普查和门诊快速筛查脆性X染色体综合征.【期刊名称】《南京晓庄学院学报》【年(卷),期】2011(027)003【总页数】4页(P63-66)【关键词】脆性X染色体综合征;FMR1基因;CGG重复序列;PCR【作者】魏婷婷;周东蕊;张红琳;付文忠;张仁敏;杜彩贺;胡芳【作者单位】东南大学学习科学研究中心,江苏南京210096;东南大学学习科学研究中心,江苏南京210096;南京晓庄学院,江苏南京211171;山东省菏泽市牡丹区畜牧局,山东菏泽274009;东南大学学习科学研究中心,江苏南京210096;东南大学学习科学研究中心,江苏南京210096;东南大学生物科学与医学工程学院,江苏南京210096【正文语种】中文【中图分类】R749.94脆性 X染色体综合征(fragile X syndrome，FraX)又称脆性X综合征，是一种发病率仅次于唐氏综合征(Down syndrome)的常见遗传性智力低下疾病，由Martin 和Bell在1943年首次报道并命名为Martin-Bell综合征.Fra X为X连锁不完全显性遗传病，占X连锁遗传性智力低下的40%［1］，据报道［2］男性发病率约为1/4000，女性发病率约为1/8000.Fra X的临床表现除认知障碍外还有前额高、耳大和下颌突出，青春期后睾丸大，关节活动度增大等体格特征，以及注意障碍和孤独症样行为等.近年来，随着遗传学和分子生物学技术的发展与应用，FraX的发病机制也渐渐为人所知，1991年Verkerk等［3］分离并用酵母人工染色体技术克隆出位于Xq27.3处的脆性X综合征的致病基因，将其命名为脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1，FMR-1)，脆性X综合征发病的分子基础就是该基因所含(CGG)n重复序列不稳定的扩增.在正常人群CGG重复数具有多态性，范围在7～50个之间，以30个居多.CGG重复数在55～200之间称为前突变(premutation)，在女性携带者中不稳定，其子女CGG重复数会增加.如果女性携带者CGG重复数超过90，其子女CGG重复数几乎均超过200，达到全突变(fullmutation)水平.此时，其CpG岛出现异常甲基化，并导致FMR1基因转录终止，其编码产物FMRP(fragile X mental retardation protein)缺如［4］，引起脆性X综合征.目前临床尚无FraX的有效治疗方法，而其高发病率给家庭和社会都造成很大的负担.本研究旨在优化FraX分子水平上的检测条件，为该病的早期诊断建立经济、简便、快速的基因筛查法，使病人早日得到对症治疗，减轻疾病负担，提高生命质量.1 材料与方法1.1 材料表型正常者外周血2 ml，EDTA抗凝，碘化钾法提取基因组DNA，置于－20℃保存.1.2 仪器与试剂PTC-200 PCR仪(MJ Research公司);引物Primer－1、Primer－2参照文献［5］由Invitrogen生物技术有限公司合成，Primer-1:5’-GGA ACA GCGTTG ATC ACG TGA CGT GGT TTC-3’，Primer-2:5’-GGG GCC TGC CCT AGA GCC AAG TAC CTT GT-3’.PCR扩增产物片段长度400～500bp(相当于n =20～53).Taq酶、dNTP、10*Taq Buffer(含Mg2+)购自Tiangen公司，DMSO、Betaine购自Sigma公司.5MKI，生理盐水，苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，70%乙醇.1.3 方法1.3.1 样本处理取抗凝血500μl加灭菌水1000 μl，充分摇匀后1000 rpm离心5 min弃上清，沉淀加5MKI150 μl，旋涡振荡60 s，加生理盐水550 μl、苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)1000 μl，1000 rpm离心5 min，小心吸取上清至另一Eppendoff管中，加异丙醇400 μl，轻轻摇匀，1000 rpm离心5 min，弃上清，加70%乙醇1000 μl，1000 rpm离心5 min，弃上清，37℃烘干多余乙醇，加100 μl灭菌水55℃水浴过夜溶解.1.3.2 常规PCR扩增PCR反应体系共50 μl，含dN TP1 μl，Primer－1、Primer－2各1 μl(10 μM)，Buffer(含Mg2+)5 μl，模板DNA1 μl，Taq酶1 μl，其余用去离子水补足.PCR反应条件，95℃5 min预变性，后经34个循环扩增，每一循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后再于72℃延伸5 min.1.3.3 热启动PCR法并加入增强剂DMSO扩增引物不变，PCR反应体系共50 μl，含dNTP1 μl，Primer－1、Primer－2各1μl(10 μM)，Buffer(含Mg2+)5μl，DMSO2.5 μl(5%)，模板DNA1μl，用去离子水补足体系49 μl，暂不加入Taq酶1 μl.PCR反应条件，95℃10 min预变性，后经34个循环扩增，每一循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后再于72℃延伸5 min.在第一次循环中退火温度下加入1 μlTaq 酶.1.3.4 采用热启动并加入增强剂DMSO及Betaine的PCR扩增引物不变，PCR反应体系共50 μl，含dNTP1 μl，DMSO2.5 μl(5%)，Betaine12 μl(5M)，Primer－1、Primer－2各1 μl(10 μM)，Buffer(含Mg2+)5 μl，模板DNA1 μl，Taq酶0.5 μl，其余用去离子水补足.PCR反应条件，95℃10 min预变性，后经34个循环扩增，每一循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后再于72℃延伸5 min.在第一次循环中退火温度下加入0.5 μlTaq酶.1.3.5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳法检测配制2%琼脂糖凝胶，取5 μl扩增产物加载样缓冲液1 μl混匀后上样，于130 V电泳30 min后成像分析结果.2 结果2.1 常规PCR扩增产物的检测用2%琼脂糖凝胶电泳检测常规PCR产物，20例样本均未检测出扩增片段，产物多为引物二聚体(图1).图1 常规PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测(扩增样本均来自表型正常人群)2.2 热启动并加入增强剂DMSO的PCR扩增产物的检测采用热启动法后20例样本中仅2例有明显特异性条带出现，重现性差，扩增效率低(图2).图2 热启动并加入增强剂DMSO的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测(样本均来自表型正常人群)2.3 采用热启动并加入增强剂的DMSO及Betaine的PCR扩增产物的检测采用热启动法并加入增强剂DMSO及Betaine扩增FMR1基因5’端CGG重复序列，20例样本均可检测出特异性扩增产物，目标带清晰，结果稳定，重复性好，扩增效率明显较常规PCR高(图3).图3 采用热启动并加入增强剂的DMSO及Betaine的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测(样本均来自表型正常人群)3 讨论3.1 PCR技术在该病基因诊断中的应用及其局限性PCR技术作为分子生物学研究的最重要技术，得以在生物科研和临床应用中广泛应用，而由于其简便、灵敏和快捷的特点在FraX的诊断中也有不可替代的优势.Fu 等［6］最先用PCR扩增包括(CGG)n重复区域在内的DNA片段，对(CGG)n重复拷贝数进行精确的测定.PCR由于简便易操作特别适用于群体筛查及前突变者的诊断，但当拷贝数过多时扩增就比较困难.本实验中在扩增FMR1基因时就遇到了PCR低效率的问题.由于该段基因富含CG(＞85%)，碱基配对时，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三对氢键，双链稳定性高，解链所需能量高，因而模板DNA解链较困难.另外，由于单链的CG富集区易于自身互补配对，形成稳定的发夹或二级结构，导致在扩增过程中引物难于结合到单链模板上，且DNA聚合酶在含有稳定二级结构的模板链上也难以延伸，反应表现为严重的非特异性扩增，出现较多引物二聚体或多聚体，并伴随目的产物量降低，或根本无靶序列的扩增.本文中图1结果显示扩增效率低且存在很多引物二聚体.3.2 热启动PCR及DMSO的应用由于模板DNA的CG含量高，解链所需能量高，而普通的DNA聚合酶(Taq酶)在95℃以上高温活性降低或失活，再者，尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性.因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物.这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增，限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪.这种方法简单、成本低，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增.本文采用一种简便、无外源性污染的热启动方法，通过控制一种关键成分即Taq酶的加入来延迟DNA 合成，直到PCR反应体系经过高温变性后，保持退火温度以上的温度下加入Taq 酶，优点有4个:(1)通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与延伸，增加有效引物的长度，从而减少了引物二聚体或多聚体的形成; (2)在扩增前的高温加热使模板DNA双链充分解链;(3)减少Taq酶处于高温的时间，保护其活性; (4)在最佳退火温度下加入Taq酶可以减少非特异性产物的产生.DMSO属于有机溶剂(Organic solvent)，其作用机制是通过脱水(Dehydration)作用导致DNA结构的不稳定性，导致GC富集区的熔点及解链温度降低，进一步提高了扩增效率.据报道，每10%的DMSO降低熔点及解链温度5.5～6℃，但10%的DMSO会降低Taq酶高达50%的活性，故而本文经研究加入5%DMSO.热启动联合应用DMSO一方面促进DNA有效解链，另一方面保护了酶的活性，增强了酶的特异性.本文中图2结果显示采用此法扩增效率比常规PCR法有提高，由于GC含量过高，仍可能存在假阴性结果.3.3 热启动PCR及DMSO和Betaine的应用热启动法与DMSO联用可以提高扩增效率，但结果不稳定，重复性差，为了进一步提高扩增效率和特异性产物的产量，提高结果的稳定性和可重复性，本文又加入了另外一种PCR增强剂Betaine(甜菜碱，三甲基甘氨酸，N，N，N-trimethylglycine)，该增强剂可降低富含GC的模板形成二级结构的可能，提高Taq DNA聚合酶的稳定性.本文图3结果显示采用该法扩增效率大大提高，产物特异性增强，而且结果稳定，具有良好的可重复性.在人类基因组中CG含量高的DNA序列广泛存在，使用常规PCR法很难(甚至根本不能)得到扩增目的产物，本文在常规PCR方法上做了一些改良，提高了CG富集区域的扩增效率及特异性，取得了较好的结果.这些方法为FXS的早期诊断建立经济、简便、快速的基因筛查法，适于临床的群体筛检和门诊的快速筛查，使病人早日得到对症治疗，减轻疾病痛苦，提高生命质量.也可为本病的进一步研究及其他高CG含量的基因的PCR扩增奠定基础.参考文献:【相关文献】［1］Warren ST，Ashley CT Jr.Triplet repeat expansion mutations:the example of fragile X syndrome［J］.Annu Rev Neurosci，1995，18:77-99.［2］ACOG committee opinion.No.338:Screening for fragile X syndrome［J］.Obstet Gynecol，2006，107:1483-1485.［3］Verkerk AJ，pieretti M，Suteliffe JS et al.Identification of a gene(FMR-1)containing a CGG repeat concident with a fragile X breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.Cell，1991，65(5):905-914.［4］Bell MV，Hirst MC，Nakahori Y，et al.Physical mapping across the fragile X Hypermethylation and clinical expression of the fragile X syndrome［J］.Cell，1991，64:861-866.［5］李东至，廖灿，黄以宁.脆性X染色体综合征快速筛查的聚合酶链反应技术［J］.中国生育健康杂志，2005，16 (1):33-37.［6］Fu YH，Kuhl DP，Pizzuti A，et al.Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability:resolution of the Sherman paradox［J］.Cell，1991，67(6): 1047-1058.。
PCR抑制剂和增强剂
PCR抑制剂和增强剂PCR抑制剂：Shames等人(1995)使用PVP( polyvinylpyrollidone)在4°C分离粪便中的细菌DNA，然后用Chelex100处理。
尽管用PVP在室温也可以分离DNA，但得到的DNA用于PCR扩增效果不够好，也许因为在更高的温度释放出了更多的PCR扣制剂。
例2：间接产生的抑制剂Yoshii T等人1992年，用单根头发提取DNA扩增线粒体DNA一段333bp的非编码区。
所有实验均截取5cm长的毛干PCR增强剂：PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。
有许多的PCR增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的PCR反应都起作用。
根据其作用和原理，可以大致分为三类：1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板(共溶剂）。
2.用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性。
3.用于优化引物和模板的结合。
#FormatStrongID_7#甜菜碱( betaine)，二甲基亚砜(DMsO)和甲酰胺( formamide)，甘油，适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结构的模板。
甜菜碱1M、DMSO1-10%(5%?)、甲酰胺1-5%、甘油1%-10%对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试剂会抑制PCR反应。
在高浓度时，许多添加剂和共溶剂都可以抑制PCR，对不同浓度的引物和模板DNA的组合都应该通过经验来确定其最适浓度。
根据我们的观点，当PCR出现问题时首先考虑的不应该是使用这些增强剂，而应该是对反应体系的控制成分进行优化，尤其是镁离子和钾离子的浓度。
这个普遍规律的一个例外是GC-Melt( Clontech公司)的应用，我们发现它常常能够克服和解决对富含G+C的模板进行扩增时效率低下的问题。
《分子克隆实验指南》有的反应中，0.1mg/ml的BSA、0.1-10%的明胶( gelatin)或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。
高成功率PCR酶 KOD FX
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甜菜碱增强长片段PCR的扩增
甜菜碱增强长片段PCR的扩增陈绪清;张晓东;梁荣奇;曹鸣庆【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2004(20)5【摘要】聚合酶链式反应(PCR)作为一项非常成熟的技术可以用于基因组序列的扩增.普通的PCR技术只适合于短片段DNA的扩增,一般在6kb以下.对于6kb至十几kb甚至几十kb以上的DNA片段的扩增就非常困难.通过添加不同化学物质,发现甜菜碱对长片段PCR的扩增有非常有效的增强作用.通过对玉米总DNA以及质粒DNA的扩增,发现1mol/L到2.5mol/L甜菜碱对改进PCR扩增效果明显.通过添加甜菜碱,可以从玉米基因组中扩增出9kb以上的单拷贝片段,从质粒中扩增出16kb以上片段.经过试验,发现不同GC含量的引物需要使用不同浓度的甜菜碱.甜菜碱可以减少甚至消除长片段PCR中的非特异性扩增.同时,我们发现其它的添加物,如DMSO,甘油,甲酰胺对长片段PCR的作用不明显.%PCR is a powerful tool for the amplification of genetic sequences.It has been widely applied in molecular biology.It is generally used to amplify short segments(several hundreds basepairs to several kilobasepairs).It is difficult to amplify a long DNA segment.Based on the sequenced genes,it is known that most intact genes are very long.And intact gene is very important for the gene to express specially and effectively.Long PCR is a very useful tool to amplify intact genes for constructing special expression vectors.We have tried several chemicals to optimize long PCR system and found betaine was the best.Betaine,as an amino acid an alogue with small tetraalkylammoniumions, could remarkably improve the amplification of long targets from the plant genomc.The suitable concentration of betaine was between 1.0mol/L and 2.5mol/L.We could effectively amplify a 9 kb DNA segment from maize genome DNA and a 16 kb DNA segment from plasmid. It was shown that different primers and different targets(different GC content)needed different concentrations of betaine.Betaine can reduce or eliminate non-special amplification. In the meantime we tried other additive chemicals,such as DMSO,glycerin,formamide. They were no notable results in long PCR.【总页数】4页(P715-718)【作者】陈绪清;张晓东;梁荣奇;曹鸣庆【作者单位】北京农业生物技术研究中心,北京,100089;北京农业生物技术研究中心,北京,100089;北京农业生物技术研究中心,北京,100089;北京农业生物技术研究中心,北京,100089【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.甜菜碱提高长距离PCR扩增效率的研究 [J], 吴斌;杨威;李强;徐秀月;刘卓刚2.甜菜碱改善水稻高GC含量DNA序列的PCR扩增 [J], 王同同;张利平;尹康权3.一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端序列 [J], 李秋莉;高晓蓉;袁晓东;刘大伟;安利佳4.从体外扩增约2kb长的DNA片段看四种dNTPs和TaqDNA聚合酶对PCR的影响 [J], 袁亚萍;蒋志戎;聂慧玲5.RT-PCR扩增A组轮状病毒VP7片段及其扩增产物的克隆 [J], 潘福娟;梁未莉;宋晓凯;郑奇崔吉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
dmso
Figure 2. Amplification of a fragment of the human retinoblastoma gene with additives DMSO andFigure 4. NMR analyses of betaine and two commercial PCR additives. Panel Aand specificity of PCR amplifications, their effects on the melting temperature of DNA may alter the optimal annealing conditions for a particular reaction. Therefore, it may be necessary to empirically determine the optimal annealing temperature if adding one or both of these agents to a particular amplification reaction.R EFERENCES1.Sarkar, G., Kapelner, S. and Sommer, S.S. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 7465.2.Varadaraj, K. and Skinner, D.M. (1994) Gene 140, 1. 3.Baskaran, N. et al. (1996) Genome Res. 6, 633. 4.Weissensteiner, T. and Lanchbury, J.S. (1996) BioTechniques 21, 1102. 5.Hengen, P.N. (1997) Trends Bioch. Sci. 22, 225. 6.Henke, W. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3957. 7.Melchior, W.B., Jr., and von Hippel, P.H. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 298. 8.Rees, W.A. et al. (1993) Biochemistry 32, 137. 9.Bookstein, R. et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 1666. 10.PCR Handbook for Taq DNA polymerase and Taq PCR Core Kit (1996) Qiagen. 11.Advantage-GC TM cDNA PCR User Manual P3091-1 (1997) CLONTECH.© 1998 Promega Corporation. All Rights Reserved.Advantage-GC is a trademark of CLONTECH Laboratories, Inc. Aldrich is a registered trademark of Aldrich Chemical Co. Perkin-Elmer is a registered trademark of The Perkin-Elmer Corporation. Triton is a registered trademark of Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.pGEM is a trademark of Promega Corporation and is registered with the U.S. Patent and Trademark Office.Product claims are subject to change. Please contact Promega Technical Services or access the Promega online catalog for the most up-to-date information on Promega products. Related ProductsProductSize Cat.#PCR Core System I200 reactions M7660PCR Core System II 200 reactions M7665。
GC测定盐酸普拉克索中三乙胺残留量
PCR抑制剂和增强剂
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2
抑制剂来源
抑制剂
来源
胆酸盐
粪便
复杂多糖
粪便，植物材料
胶原质
组织
血红素（heme） 血液
腐植酸
土壤，植物材料，自然界水
黑色素
头发，皮肤
尿素
尿
血色素hemoglobin 血液
靛青染料
粗斜纹棉布
聚苯乙烯，聚丙烯 紫外线照射塑料管
蛋白酶
牛奶
钙离子
牛奶，骨头
A
3
抑制剂的作用浓度
SDS
苯酚
乙醇
异丙醇 乙酸钠 氯化钠 EDTA 血色素 肝素 尿素 氯高铁血 红素 丹宁酸
离子去污剂 ，蛋白变性，0.01%即可完全抑制PCR反应， 0.005%可显著降低产量 蛋白变性，0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降 低产量 大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些系统中可增加 产量。 抑制作用比乙醇稍强 大于5mM时抑制PCR反应 大于25mM时抑制PCR反应 0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。
A
9
2.用于保护聚合酶的活性和稳定性的增强剂
• 有的反应中，0.1mg/ml的BSA、 0.1-10％的明胶（gelatin） 或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这 类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸 附。
• BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用. • 非离子去污剂，例如Tween®-20, NP-40和Triton® X-100
等，可以抵抗痕量的强离子去污剂的抑制作用，比如 0.01%的SDS。
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3.用于优化引物和模板的结合
• 铵离子的添加，可以减少引物和模板的错配，提高反应的 特异性，可以让PCR对反应条件的要求更低，所以很多 PCR试剂都包含了10-20mM的硫酸铵。
PCR抑制剂和增强剂
不添加任何增强剂
PCR体系中加入400ng/µl BSA
PCR体系中加入150ng/µl gp32
加和不加增强剂的比较
结果1
抑制剂 不加增强 剂时的抑 制水平 1mM 1mM >10µg/µl 0.1ng/µl 加入增强剂 后的抑制水 平 1mM 10µM <100µg/µl 10ng/µl 增强剂效果
EDTA FeCl3 bilirubin（胆红素） Humic acid， Hemin，tannic acid
无效 100倍 <10倍，不明显 100倍
fulvic acid
1ng/µl
100ng/µl
100倍
结果2
• 1. BSA和gp32都不能减少最小浓度的下列抑制剂的抑制 作用：0.1M 氯化钠，0.1M SDS，10%Triton X-100，110µg/µl任何一种胆酸盐，EDTA。 • 2. hemin的抑制作用可以被BSA或gp32明显减轻（1000 倍），但其降解产物bilirubin却不能（小于10倍）。 • 3.氯化铁在含BSA或gp32时，抑制水平降低100倍（1mM VS 0.01mM），在氯化铁浓度大于1mM时，因为形成难 溶的氢氧化物，释放氢离子，PCR反应体系的pH随着氯 化铁浓度的增大迅速降低。没有其它抑制剂影响pH值， 即使是在很高的浓度。
1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的 模板的增强剂
• 甜菜碱（betaine），二甲基亚枫（DMSO）和甲酰胺 （formamide），甘油，适合于扩增高GC含量和形成复杂 二级结构的模板。 • 甜菜碱1M、DMSO1-10％（5%？）、甲酰胺1-5％、甘油 1％-10％对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试 剂会抑制PCR反应。
DMSO in PCR
1.如果要增加特异性，要考虑是否升温，复性时候的较高温度有利于筛选特定片段，减少其他GC丰富片段的竞争。
2.考虑使用甘油：加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.3.使用甜菜碱：DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final concentration of 5%, although there are reports in the literature ofgenes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may benecessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also bebeneficial in GC-rich regions.There was a comparison published in Promega Notes 65 p 27-29 where the effectiveness of betaine and DMSO, used separately and together inreactions, where compared to commercially available PCR additives, alongwith NMR spectra confirming that some of these expensive additives arelittle more than betaine! In this study, the use of 5% DMSO aloneproduced a number of non-specific bands, and a strong specific band,while 1M betaine used alone resulted in the specific band alone, butprobably about half the amount of product. Combining DMSO and betainetogether in the reaction resulted in the single specific band, butperhaps in slightly greater proportions than when using betaine alone.甘油ji及DMSO等PCR佐剂是增加特异性的,前提是你的产物中有杂带, 但是目的条带也有的情况下才加, 因为PCR佐剂在增加特异性的同时也会降低PCR的产量即PCR的效率.而且,这2种不必同时加,加5%的甘油或者10%的DMSO即可.4.DMSO反应体系中未加入DMSO时出现多条低效扩增带, 经测序证实全为非特异扩增带. 如加入DMSO 后仅有一条高效扩增带, 测序证实正是目标片段(图略) . 另一方面,DMSO浓度过高时又同时使Taq酶变性失活, 反而降低扩增效率. (附图b) 中DMSO浓度从14%～20%的过程就是Taq酶活性逐渐被抑制直至几乎完全丧失的过程. 有学者认为,PCR 反应中DMSO 的加入量以019%～2%为最佳, 如达10%则Taq 酶活性会被明显抑制.这可能是针对50μL 反应体系含215UTaq 酶的标准反应而言. 我们的结果表明, 为得到最佳扩增效果, 应使用较高浓度的DMSO, 由此造成的对酶活性的影响可经增加Taq酶用量(5U/50μL反应体系) 来消除. 这样虽酶的用量加了倍, 但因扩增效率和成功率的大大提高而避免了更多的浪费.5.尝试使用BSA Various authors recommend DMSO and glycerol to improveamplification efficiency (higher amount of product) and specificity (no unspecific products) of PCR, when used in concentrations varying between 5-10% (v/v). In the multiplex reaction, however, these adjuvants gave conflicting results. For example, 5% DMSO improved the amplification of some products, decreased the amount of others whereas some loci were not influenced at all. Similar results were obtained with 5% glycerol .BSA, in concentrations of up to 0.8µg/µl appeared to increase the efficiency of thePCR reaction much more than either DMSO or glycerol. It should be noted that BSA did not have an inhibitory effect on any of the loci amplified.6.Bovine Serum Albumin (BSA):100 μg/ml - 1 ug/ul, 0.01% - 0.1% (w/v)The addition of albumin to tissue DNA samples increases theamount of DNA generated by neutralizing many deleterious factorsfound in tissue samples which can inhibit PCR. Concentrations of up to 0.8 μg/μL may increase the ef ficiency ofa PCR reaction much more than either DMSO or glycerol.。
cDNA芯片制备条件的优化
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2005,13(4):516~523*基金项目：国家基础研究重点发展规划(973)项目（No.TG2000016104）和全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目（No.200151）资助。
李长绿：男，1975年生，博士。
E-mail:<lichanglv@>.**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<chxwu@>.收稿日期：2004-05-14接受日期：2004-09-20·研究论文·cDNA 芯片制备条件的优化*李长绿王秀利李宁吴常信**(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100094)摘要:应用SpotBotT M 芯片点样仪对4种不同的芯片点样液(3×SSC 、50%DMSO 、3×SSC+1.5mol/L 甜菜碱和MSP)和5个不同公司生产的7种芯片片基(UltraGAPS T M 、GAPS Ⅱ、SuperAmine 、SuperAmine Barcoded 、Baio 氨基载玻片、PL-100C 多聚-L-赖氨酸片基和POLY-PREPTM 片基）进行了比较分析，发现UltraGAPS TM 、GAPS Ⅱ、SuperAmine 和SuperAmine Barcoded 片基用3×SSC+1.5mol/L 甜菜碱能得到最佳的点样和杂交结果。
同时对克隆PCR 产物的扩增和纯化方法、用于点样的DNA 样品的浓度、点样环境条件(温度、相对湿度等)、点样后芯片的处理方法、探针的标记方法、芯片的杂交及杂交后的处理等进行了比较、分析和优化。
应用优化后的条件成功地在每张芯片上点制27648个点，并杂交、扫描得到高质量的芯片结果。
关键词：cDNA 芯片；杂交；点样；优化Optimization of cDNA MicroarrayLI Chang-Lu WANG Xiu-Li LI Ning WU Chang-Xin**()Four types of printing solvent (3×SSC,50%的DMSO,3×SSC+1.5mol/L betaine and MSP)and seven printing sub-strates (UltraGAPS T M substrates,GAPS Ⅱsubstrates,SuperAmine Barcoded substrates,SuperAmine substrates,Baio Amine slides,PL-100C Poly-L-Lysine slides and POLY-PREP TM slides),came from five different companies,were compared and analyzed with the spotting robot of SpotBot TM .The results showed that the combination of four slides,UltraGAPS TM ,GAPS Ⅱ,SuperAmine andSuperA-mine Barcoded with 3×SSC+1.5mol/L betaine could produce the best printing and hybridization results,the optimized pa-rameters.At the same time,a comprehensive comparison,analysis and optimization of the amplification methods of clone DNA,the purification methods of PCR products,the concentrations of arrayed DNA in the printing solutions,the printing environment condi-tions (including environmental temperature,relative humidity and so on),the treatment methods of substrates after printing,the label-ing methods of probe,the conditions of hybridization and post-hybridization washing were carried out.The microarrays with 27648spots per substrate were successfully produced,and the high quality hybridization results were subsequently achieved using these opti-mizedconditions.cDNA microarray;hybridization;printing;optimizationcDNA 芯片又称为DNA 微阵列(microarray)、DNA 芯片或基因芯片，于20世纪90年代中期诞生于美国的斯坦福大学(Schena .,1995;1996)。
PCR抑制剂和增强剂
3.用于优化引物和模板的结合
• 铵离子的添加，可以减少引物和模板的错配，提高反应的 特异性，可以让PCR对反应条件的要求更低，所以很多 PCR试剂都包含了10-20mM的硫酸铵。
• 氯化四甲胺tetramethyl ammonium chloride（TMAC）
（15-100mM ）也起到类似的作用
4.其它增强剂
• PEG • 亚精胺 • 单链DNA结合蛋白
例：Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein
• 已知抑制剂：
离子去污剂 ，蛋白变性，0.01%即可完全抑制PCR反应， 0.005%可显著降低产量 蛋白变性，0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降 低产量 大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些系统中可增加 产量。 抑制作用比乙醇稍强 大于5mM时抑制PCR反应 大于25mM时抑制PCR反应 0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。 1mg/ml 0.15I.U./ml 20mM（相当于10μl PCR体系中含0.6μl尿液） 0.1ng/μl
的不应该是使用这些增强剂，而应该是对反应体系的控制
成分进行优化，尤其是镁离子和钾离子的浓度。这个普遍
规律的一个例外是GC-Melt（Clontech公司）的应用，我 们发现它常常能够克服和解决对富含G+C的模板进行扩增 时效率低下的问题。
•
《分子克隆实验指南》
• Frackman et al.(1998) have demonstrated (using NMR analysis) that the PCR additive provided by QIAGEN in their PCR core kit (Q-Solution) and that provided by CLONTECH in the Advantage-GC cDNA PCR kit is in fact Betaine which is available at a fraction of the cost as a 5M solution from Sigma-Aldrich (cat. # B 0300)
PCR反应体系有关的过程DOC
PCR反应体系有关的过程姓名：于烨敏学号：11243220 班级：113第一部分1、 PCR原料：DNA模板:模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度，可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。
上游引物和下游引物：是人工合成的短的单链DNA片段（寡核苷酸），经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。
当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。
引物的量不能太多，过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。
聚合酶：聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。
由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性，在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。
对于一般的PCR实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。
由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。
单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。
四种dNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）：是合成DNA新链的原料。
dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP，但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。
缓冲液：为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。
Mg离子：Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物－模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物－模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。
细胞蛇的研究进展
2007年,英国牛津大学的刘骥陇等在研究果蝇U 小体和P 小体(U 小体和P 小体是真核生物细胞质中的无膜细胞器)的功能关系时,用4种针对Cup (P 小体中的一种蛋白质)的抗体,对雌性果蝇的卵巢组织进行免疫组织化学染色,染色结果除了预期标记上的P 小体外,还标记出了长条形的丝状结构[1]。
这种结构的形状和数量与纤毛很相似,导致当时以为在果蝇中找到了有纤毛的新细胞类型。
但后来的一系列实验表明,该结构与纤毛没有关系,于是将其命名为“细胞蛇”。
最初是抗Cup 抗体不纯产生假象,意外发现的细胞蛇,而采用亲和层析纯化后的抗Cup 抗体无法再DOI:10.16605/ki.1007-7847.2020.10.0258细胞蛇的研究进展收稿日期:2020-10-22;修回日期:2020-11-19;网络首发日期:2021-07-27基金项目:宁夏自然科学基金项目(2020AAC03179);国家自然科学基金资助项目(31560329)作者简介:李欣玲(1999—),女,广西贵港人,学生;*通信作者:俞晓丽(1984—),女,宁夏银川人,博士,副教授,主要从事干细胞与生殖生物学研究,E-mail:********************。
李欣玲,张樱馨,李进兰,潘文鑫,王彦凤,杨丽蓉,王通,俞晓丽*(宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室临床医学院基础医学院,中国宁夏银川750000)摘要:细胞蛇是近年来细胞生物学研究的热门方向之一,由于其在细胞的增殖、代谢和发育上具有一定的生物学功能,因此,对一些疾病如癌症等的临床诊断或治疗具有一定的指导意义。
细胞蛇是由三磷酸胞苷合成酶(cytidine triphosphate synthetase,CTPS)聚合而成的无膜细胞器,其形成过程及功能在不同类型的细胞中不尽相同。
例如:细胞蛇能促进癌细胞增殖,并使患者病情恶化;过表达的细胞蛇可抑制神经干细胞增殖,影响大脑皮层发育;在卵泡细胞中,细胞蛇相当于CTPS 的存储库,在卵子发生过程起到促进细胞增殖和代谢的作用。
溶剂的选择
第四章溶剂选择I.介绍选择适当的溶剂可以提高反应速率，提高反应的可重复性和操作的便利性，并且能够确保目标产物的质量和产率。
另外，从减少浪费以及溶剂的有效回收和重复使用上来说，溶剂的选择也是相当重要的。
以上这些都对合成产品的生产效率和生产成本有着直接的影响。
在研发的早期阶段，以任何方式提供的原料都是至关重要的，而溶剂的正确选择是为了能够保证在规定时间内，在难度最小化的条件下得到目标产物。
对于溶剂的分类，溶剂化，以及重要的物理参数的简单讨论如下，更多细节请参阅Reichardt关于溶剂的文章[1]。
I.A. 溶解性和主要溶剂的性质溶剂的许多性质取决于其官能团。
溶剂的类别包括• 质子性溶剂，或氢键供体的溶剂（HBD，路易斯酸），例如，H2O，NH3，CH3OH和AcOH；• 氢键受体的溶剂（HBA，路易斯碱），比如，H2O，Et3N，EtOAc，THF，NMP（N-甲基吡咯烷酮）和丙酮；• 极性非质子溶剂，或称为“非羟基溶剂”，例如，DMSO和DMF；• 氯代烷烃和氟代烷烃溶剂；• 饱和烃类和不饱和烃类溶剂[1]。
当溶质被分散在溶剂中，它们就叫做被溶解。
溶解，即每一个被分散的分子或者离子的周围都被溶剂分子紧密约束着。
被分散在水中的分子或者离子叫做被水合。
溶解可以是一个吸热的过程，也可以是放热的过程；类似的，结晶也可以是吸热或者放热的过程。
（实验室中的结晶过程的放热现象可能不易被注意到,但是在放大生产时,结晶过程中反应釜的温度升高1-2℃是很普遍的）。
溶剂化的程度随着离子电荷的增大和离子半径的减小而增大。
不同溶剂的离子溶剂化值（包围一个溶质分子的溶剂分子数）不同。
例如，Li+在环丁砜中的离子溶剂化值为1.4，在甲醇中上升至7，在乙腈中为9，在水中达到21[1]。
溶剂化程度能够影响反应性。
在相转移催化剂下产生裸露的阴离子只能最低限度的在有机溶剂中溶剂化，其反应性比高溶剂化的离子要大得多。
极性非羟基溶剂，例如DMSO，能够将阳离子溶剂化，但C-H键不能被极化成为明显的溶剂化阴离子。
恒基生物 Betaine Solution 用户指南说明书
B0300ug Rev 04/231User GuideBetaine Solution5 M, PCR ReagentB0300Product DescriptionBetaine, also called trimethylglycine orN,N,N-triethylammonium acetate, is an analog of glycine with three methyl groups.1 Betaine is a PCR enhancing reagent that is widely used for improving the yield and specificity of PCR products, especially for the amplification of targets rich in GC content or those that form secondary structures resulting in poor yield. Betaine facilitates DNA strand separation and decreases secondary structure of GC-rich regions.2 Betaine has been broadly used to optimize multiplex and ‘long and accurate′ polymerase chain reaction (LA-PCR). The addition of 1.0-1.7 M aqueous betaine to a PCR mixture has been reported to reduce the base pair composition dependence on DNA strand melting.3Quality Specifications•Suitable for molecular biology applications with high GC content. Upon addition of BetaineSolution to 1.2 M, a 994 bp human gene target with 64% GC content is amplified via PCR with JumpStart™ Taq DNA Polymerase, while no amplification is detected in the absence of Betaine Solution.•DNase free: No degradation of HindIII-digested lambda phage DNA detected after incubation with 1.2 M Betaine Solution for 16 hours at 37 °C. •RNase free: No degradation of tRNA detected after incubation with 1.2 M Betaine Solution for 16 hours at 37 °C.•Endonuclease free: No nicking or linearization of pBR322 plasmid DNA detected after incubation with 1.2 M Betaine Solution for 16 hours at 37 °C. Applications• Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)4 • PCR for genomic DNA amplification 5 •Quantitative PCR (qPCR)6 and RT-qPCR• PCR amplification of CGG repeats in genomic DNA 7•Reverse transcription for single cell cDNA library preparation via Smart-seq-total 8Intended UseThis product is for R&D use only. Not for drug,household, or other uses. Please consult the Safety Data Sheet for information regarding hazards and safe handling practices.StorageStore at 2-8 °C.Directions for UseAdd Betaine to a final concentration of 1.0 – 1.7 M in a nucleic acid amplification mixture prior to initiation of thermocycling/heating.References1. Day CR and Kempton SA. Biochim biophys acta.,1860(6):1098-106 (2016). 2. Jensen MA, et al. PLoS ONE, 5(6):e11024.(2010). 3. Rees WA, et al. Biochem., 32(1):137-44. (1993). 4. Kostic T, et al. Appl Microbiol Biotechnol.,99(18): 7711–7722. (2015). 5. Azaiez H, et al. Hum Mutat., 24(4):305-11.(2004). 6. Milte CM, et al. Eur J Nutr., 57(1):363-372.(2018). 7. Saulto A, et al. J Mol Diagn., 7(5):605-12.(2005). 8. Isakova A, et al. Proc Natl Acad Sci USA.,118(51):e2113568118. (2021).The life science business of Merck operatesas MilliporeSigma in the U.S. and Canada.Merck and Sigma-Aldrich are trademarks of Merck KGaA, Darmstadt, Germany or its affiliates.All other trademarks are the property of their respective owners. Detailed information on trademarks is available via publicly accessible resources.© 2023 Merck KGaA, Darmstadt, Germany and/or its affiliates. All Rights Reserved.B0300ug Rev 04/232Product OrderingOrder products online at .Description Catalogue NumberJumpStart™ Taq DNAPolymerase D4184Deoxynucleotide (dNTP)Mix, containing 10 mMeach of dATP, dCTP, dGTP,and dTTP sodium saltsD7295 Nuclease-free water W1754Custom ordered primersspecific to gene target OLIGO GenElute™-E Single SpinDNA Cleanup Kit EC600 GenElute™ PCRClean-Up Kit NA1020 GenElute™ GelExtraction Kit NA1111Precast Agarose Gels P6222 P5472 P6097 P5972 P57221 kb DNA Ladder D0428 Water, Microbial DNA-free MBD0025 Nuclease-Free Water,for Molecular Biology W4502 JumpStart™ Taq Ready Mix P2893 RED Taq® Ready Mix P0982 Glycerol-free JumpStart™Taq DNA Polymerase D9310 DMSO D8418 Single strandbinding protein S3917 BST Max DNA Polymerase SRE0113 NoticeWe provide information and advice to our customers on application technologies and regulatory matters to the best of our knowledge and ability, but without obligation or liability. Existing laws and regulations are to be observed in all cases by our customers. This also applies in respect to any rights of third parties. Our information and advice do not relieve our customers of their own responsibility for checking the suitability of our products for the envisaged purpose. The information in this document is subject to change without notice and should not be construed as a commitment by the manufacturing or selling entity, or an affiliate. We assume no responsibility for any errors that may appear in this document. Technical AssistanceVisit the tech service page at/techservice.Terms and Conditions of SaleWarranty, use restrictions, and other conditions of sale may be found at /terms. Contact InformationFor the location of the office nearest you, go to /offices.。
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Figure 2. Amplification of a fragment of the human retinoblastoma gene with additives DMSO and
Figure 4. NMR analyses of betaine and two commercial PCR additives. Panel A
and specificity of PCR amplifications, their effects on the melting temperature of DNA may alter the optimal annealing conditions for a particular reaction. Therefore, it may be necessary to empirically determine the optimal annealing temperature if adding one or both of these agents to a particular amplification reaction.
R EFERENCES
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PCR Handbook for Taq DNA polymerase and Taq PCR Core Kit (1996) Qiagen. 11.Advantage-GC TM cDNA PCR User Manual P3091-1 (1997) CLONTECH.
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