杂交技术

1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素： 选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏； ②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少； ③结合后应不影响核酸分子与探针分子的杂 交反应； ④非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也 易被洗脱掉。
② G：C碱基对含量应占40～60％；过 少，则不易杂交，或杂交双链不稳定；过 多，则会产生非特异性杂交
③探针内部的互补碱基对不应大于4bP， 否则会形成探针内部的“发夹”结构。
④同一碱基的连续出现次数不应超过4次 ⑤探针设计完后，最好利用基因库软件进 行分析，并与已知的各种基因序列进行同 源性比较，探针与非目的基因序列有70％ 以上的同源性，或连续有8个以上的碱基 序列相同，则放弃。
④离子强度：离子强度过低，不利于复性
⑤pH值：pH值在5～9范围内，不影响复性பைடு நூலகம்
速度，过低或过高则影响。 ⑥DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基 因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越 少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反 应速度越慢。
（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素
①DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越 快。加入足够的DNA并尽量减少杂交的体积， 一般以每平方厘米滤膜面积加50～100μ l 杂交液为宜。
碱变性等
常用方法是加热变性和碱变性。
DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度 增加，这种现象又称增色效应。 熔解温度（melting temperature Tm值） 当增色效应达到最大值的50%时温度 Tm值表明DNA溶液中一半的DNA双链 已解离为单链 Tm值反映了DNA变性的程度和难易， Tm值越大，变性越难 大多数DNA的Tm值在85～90℃左右。
但RNA变性方法与DNA不同: 不能用碱变性，
因为碱导致RNA水解。
RNA的变性常与电泳同时进行，常有3种方法:
• • • 聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳 甲醛变性凝胶电泳 甲基氧化汞电泳
RNA经变性电泳后，一般可进行转移 （印迹），其印迹方法与Southern方法 相同。
对含甲醛的凝胶，可用DEPC预处理水 漂洗，以去除甲醛。 固定方法，常用真空烘烤（80℃）2h
②DNA探针的长度：在杂交过程中，待 测DNA固定在膜上，只有探针可以自由扩散， 探针越长，扩散越慢，变性越慢。因此探 针的长度不宜过长，一般以10～50bp。
③离子强度：离子强度对变性影响较大。 一 般 常 用 5× 或 6×SSC （ 1×SSC 为 0.15mol/L Nacl和0.015mol柠檬酸钠）。 ④温度：温度对于杂交（复性）反应的快
3．杂交信号的检测
⑴放射自显影：探针标记了放射性核 素，如32P、35S、125I或131I。 其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤 膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗盒， 置－70℃曝光一定时间。 经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点， 根据斑点密度及大小，判断被检测核酸 是否有与探针相应序列及大小。
液相杂交
膜上印迹杂交的基本操作流程
用印迹技术将凝胶电泳分离的核酸片段转 移到特异的固相支持物上（转移后的核酸片 段将保持其原来的相对位置不变）。 再用标记的核酸探针与固相支持物上的核 酸片段进行杂交。 最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过 放射自显影等检测方法显示标记的探针的位 置及量的多少。
③洗液：将膜上未与DNA杂交的及非特异 性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非 特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温 度较低，而特异性杂交体由于稳定而保留 在滤膜上。 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的 洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度 逐渐上升（室温～37℃～65℃）。即逐渐 增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为 下一步反应（检测）做好准备。
2．杂交（固－液相杂交）技术
DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性 和具有同源序列的两条单链的复性过程。 RNA 分 子 杂 交 也 涉 及 变 性 和 复 性 过 程 （这种变性是单链RNA分子内部发夹结 构打开过程）。
因此以DNA分子杂交为例进行介绍。
（1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成 单链DNA的过程。 方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性
缺点：
①与核酸的结合力较弱 （因为是靠疏水作 用），在杂交及洗脱的进程中，核酸会慢慢 脱落，特别是在高温情况下，更容易脱落。 对于小分子量DNA片段结合力更弱，因此不 太适合小分子DNA片段的杂交。 ②硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后 更易破损，因此操作不方便，须特别小心。 硝酸纤维素膜与核酸的结合，有赖于高盐浓 度，而高盐溶液又不适合于电转印迹法
3.探针的标记物与标记
一种理想的标记物应具备的特性：
①高度灵敏性； ②标记物不影响探针的碱基配对特异性、 杂交特异性、杂交稳定性及Tm值； ③高度特异性（发生杂交能检测到，否 则检测不到）；
3.探针的标记物与标记
④较高化学稳定性，保存时间较长； ⑤标记方法及检测方法简单； ⑥对人体无损伤，对环境无污染； ⑦价格低廉。
慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的
因素。
一般认为杂交温度为：68℃（不含甲酰 胺）；当含50％甲酰胺时，在42℃进行 杂交。 洗膜温度一般认为55℃～65℃。 对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据 下列公式推算： Tm=4℃×GC＋2℃×AT 杂交温度一般比Tm值低5℃，55℃（20bp)
⑤杂交时间：一般应为Cot1/2的1～3倍。
(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记
1.探针的概念：
•在化学及生物学意义上的探针(Probe)，是指 能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子， 并可被特殊的方法所探知 •核酸分子探针则是指带有标记物，能与互补核 酸序列退火杂交的特定已知核酸片段。 •探针的设计和选择影响核酸杂交实验结果的高 度特异性、正确性。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
e.固定，对于硝酸纤维膜，可真空下80℃烘烤 2h(亦可无真空)，对尼龙膜还可用短波紫外线 （波长254nm）照射几分钟进行固定。
Northern印迹法
基本原理与Southern印迹相同
2.探针的种类、选择及特点 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探
针、寡核苷酸探针
选择：寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷
酸片段，并带有标记物
特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低
设计寡核苷酸探针遵循的原则：
①探针长度：一般要求10～50bP。过短 则特异性降低，过长，则合成困难、杂交 时间延长，亦会出现非特异性杂交
目前常用的固相支持物
硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 化学活化膜
滤纸
硝酸纤维素滤膜
具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力 特 别 是 在 高 盐 浓 度 ， 其 结 合 力 可 达 80μg/cm2～100μg/cm2。 这种结合主要靠疏水作用。
非特异性吸附核酸（探针）能力较弱，因此
杂交信号本底值较低。
复性的过程是相当复杂的。
复性则需要相对较长的时间才能完成。分子碰撞 机率越大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞， 只有正确配对才是复性的开始。
使变性DNA完全恢复天然的双链结构，则要在低
于Tm值25℃的温度下维持相当长的时间才能完成。
复性的（速度）过程的影响因素： ①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞机率 越大，复性速度越快。 ②DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速 度较慢，碰撞机率较少，同时又很难形 成正确配对，因此复性速度较慢。 ③温度：温度过高，有利于DNA变性而 不利于复性；而温度过低，碰撞机率减 少，易形成局部错误配对，适宜的温度 是较Tm值低15℃～25℃。
Southern印迹法
a.DNA分子经限制内切酶酶切。酶切变成 合适长度的DNA片段。一般理想是0.5～ 10Kb，因片段大小直接影响转移效率。 b.在琼脂糖凝胶中进行电泳。分离DNA片
段 ， 与 DNA 分 子 量 标 准 参 照 物 比 较
（Marker）, EB染色后观察DNA片段大小
c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使DNA 变性，即将双链DNA变成单链DNA。如果DNA片 段较大(大于15kb)，可在变性前，用稀盐酸 （0.2mol/L）处理10min,因为片段的大小直接 影响转移率速。小于15Kb，转移1h。
尼龙膜
•未经特殊处理的尼龙膜，叫普通尼龙膜。经 过了正电荷基团修饰的，又叫特殊尼龙膜。 •特殊尼龙膜带有正电荷，对核酸的结合力要 比硝酸纤维素膜强好多倍。 •经短波紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱 基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联。因此 特别适用于小分子核酸片段的杂交。 •碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上， 特别适用于菌落原位印迹法。
放射性核素标记： 32P、35S、3H、125I、131I
优点是灵敏度极高，可以检测到10-14g
～10-18g物质； 缺点是对人体有一定影响，对环境有污 染。
非放射性标记物： 半抗原（生物素、地高辛）； 配体； 荧光素； 化学发光物； 产生颜色的物质
（二）杂交
固相杂交 膜上印迹杂交
细胞原位杂交
第三节 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术的基本原理
按碱基互补配对原则，具有一定同源性 的两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链 杂交过程具有高度特异性（即使有一个 碱基不配对都不能杂交）。 通过检测探针是否发生了杂交及杂交量 多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和 定量分析。 核酸分子杂交的成败，关键在于探针。
尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹
②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
Southern印迹法 Northern印迹法
Yz 小时/Cot1/2＝ 5×10X Co＝单链DNA浓度，t1/2＝反应一半的时间 Y为探针DNA的复杂性，即片段大小（Kb） Z为杂交体系的体积(ml)。 经验杂交时间8～16h，过夜。
×2
⑥减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前 先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭， 同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。 ⑦促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖 (dextran sulfate,Mw 500000)能促进DNA 链 间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子， 从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应， 促进杂交反应速度。 如10％硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提 高10～100倍。
③pH值，pH值在5～9之间范围内，Tm 值变化不明显，当pH值大于11.3时，所 有氢键均被破坏，DNA完全变性。这就 是碱变性的原理。 ④变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和 氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用 的变性剂是甲酰胺和脲。
通常用50％的甲酰胺使Tm值降低30℃
（2）复性 单链核酸重新缔合成双链的过程。
（4）杂交操作步骤
①预杂交：将膜放在预杂液中，即不放 探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑 鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂 交位点。
②杂交：杂交液中除含封闭物质外，还 含有10％硫酸葡聚糖和探针。探针如果 是双链DNA，则需要进行变性处理。温度 68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲 酰胺），杂交时间：8～16h过夜。
Tm值的影响因素：
①DNA的碱基组成，Tm值主要受G：C碱基 对数量多少的影响，有一个经验公式为： Tm＝(G+C)%×0.41＋69.3 ②溶液的离子强度，DNA链上的磷酸基团 带负电荷，在无盐的水中，DNA在室温条 件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子 可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链 的稳定性增加，Tm值亦会升高。