医学检验技能操作

红细胞计数

1、加稀释液取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。

2、加血用清洁干燥微量吸管或一次性微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，擦去管外余血，

轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液清洗吸管2-3次，立即混匀。

3、充池混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3-5分钟，待

细胞下沉后于显微镜下计数。

4、计数用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞。

5、计算

红细胞/L=N/200×1012/L

N：表示5个中方格内数得的红细胞数。

白细胞计数

1、加稀释液用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。

2、吸取血液用微量吸管吸取新鲜全血或末梢血20ul，擦去管尖外部余血，将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管2-3次。

3、混匀将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。

4、充池再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer 计数板的计数池中，室温静置2-3分钟，待白细胞完全下沉。

5、计数在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。

6、计算白细胞=4个大方格内白细胞数（N）/20×109/L

白细胞分类计数

1、将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。

2、镜下观察低倍镜下观察白细胞的分布和染色情况。

3、观察选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见到的每1个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器作好记录，共计数100个白细胞。计算求出各类细胞所占的百分比率。

血涂片的制备和瑞氏染色

1、采血：用微量吸管在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。

2、推片：左手平执载波片，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载波片呈30度到45度角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌、头、尾三部分。

3、干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。

4、标记：在载玻片的一端用记号笔编号。

5、染色：血涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满血涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。

6、冲洗：1分钟后，用流水冲去染液，待干。

7、观察结果：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体尾交界处的血细胞。

ABO血型鉴定

（一）正定型法

1、5%被检红细胞生理盐水悬液制备抗凝血离心或红细胞自然沉降后取下层红细胞2 滴于小试管中，加入生理盐水2 ml ，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀，2500r/min 离心3分钟后弃去上清液，重复洗涤三次后自管底吸取1滴血红细胞加入19滴生理盐水中，此即为5%的红细胞生理盐水悬液。

2、标记试管取小试管2 支，分别标记抗A、抗B。

3、加标准抗血清分别加入抗A、抗B标准血清各1滴于相应标记的试管中。

4、加入红细胞悬液分别加入被检者5%红细胞生理盐水悬液1滴于各试管中，混匀，立即以1000r/min，离心1min。

5、观察结果先观察上层液有无溶血现象，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，使管底的红细胞慢慢浮起，肉眼观察有无凝集、再用低倍镜观察凝集强弱程度，如轻微凝集或不见凝集，必须将反应物倒于玻片上，再以低倍镜观察。

6、判断结果

（1）凝集结果判断标准：红细胞呈均匀分布，无凝集颗粒，显微镜下红细胞分散存在，无凝集靠拢现象为阴性；红细胞出现凝集为阳性。

（二）反定型法

1、分离血清 2500r/min，离心3min，分离血清。

2、标记并加被检者血清取小试管3支，分别标记A、B、O 字样，于各管加入被检者血清1滴。

3、加标准红细胞按标记分别加入5%的A、B、O型标准红细胞生理盐水悬液1滴，混匀，立即以1000r/min，离心1min。

4、观察结果先观察上层液有无溶血现象，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，肉眼观察有无凝集，再用低倍镜观察。

5、判断结果

6、凝集结果判断标准：同正定型法。

网织红细胞计数

1、加染液取煌焦油蓝生理盐水溶液 2 滴，再加入新鲜全血 2 滴，立即混匀，置室温下15-20分钟。

2、制备涂片取1 小滴制成薄血涂片，自然干燥。

3、观察在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

4、计数在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。

5、计算网织红细胞分数数=计数的网红细胞数/1000

尿蛋白定性检查（加热乙酸法）

1、加尿液取大试管1支，各加清晰尿液5ml。

2、加热倾斜试管下端，在酒精灯上加热尿液上1/3段，煮沸即止。

3、观察轻轻直立试管，在黑色背景下观察煮沸部分有无浑浊。

4、加酸后再加热滴加5%的乙酸溶液2-4滴，再煮沸后立即观察结果。，

5、判断结果判断阳性程度及蛋白质的含量。

革兰染色

1 制玻片用接种环挑取一环生理盐水放在载玻片中央，再挑取一环菌种放入生理盐水中涂片。

2 固定将涂片在火焰外焰上过2-3回，放凉。

3 初染滴加结晶紫染色液，染1min，冲洗，甩干。

4 媒染滴加革兰氏碘液，作用1min，冲洗，甩干。

5 脱色滴加95％酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，冲洗，甩干。

6复染滴加复染液，复染30s，冲洗，甩干，镜检。

抗酸染色

1）初染

用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

2）脱色

3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。

3）复染

用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。

药敏实验

1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

琼脂平板分区划线分离法

(1)灭菌接种环，待冷，取1环葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液。

(2)琼脂平板倒放于桌面，左手抓握起平板底部，尽量直立使琼脂面靠近酒精灯火焰，以免杂菌污染。右手持沾菌接种环在平板表面上端来回划线，涂成一薄膜(第1区，约占平板面积的1/5)。划线时接种环与琼脂表面呈30°～45°，用指力轻轻来回滑动密集划线，切忌划破琼脂。

(3)灭菌接种环，杀死环上剩余的细菌，待冷，转动培养皿约60°～70°，将接种环通过第1区3～4次，作连续划线为第2区，约占平板面积1/4，待冷划第3、4区(图1-3-1)。

(4)划线完毕，盖好皿盖，在平板底部用记号笔注明标本(细菌)名称，接种日期及接种者，平板倒置于35℃～37℃温箱培养24h。

(5)取出平板观察菌落分布情况，注意3区和4区是否有单个菌落，并记录菌落的大小、形状、色泽、边缘、透明度等特征(图1-3-2)。