核酸的性质及研究方法

A260
1 .4 100%Leabharlann Baidu
1 .2
1 23
1 .0 60
T 80 T m t \ 0mC
T 100 m
某些DNA的Tm值
Poly d(A-T) DNA
1
2
Poly d(G-C) 3
熔解温度（Tm）
浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完 全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大 增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。
例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶
Eco R I
属名 种名 株名 序号
★限制酶的命名：E.coRI
第一位： 属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号
限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限 制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外 重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀， 用来解剖纤细的DNA分子。
部分双螺旋解开
无规则线团
DNA的变性过程
链内碱基配对
★ 变性因素 ：
热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
★ 变性后的理化性质 ：
260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。
★ DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很 窄的温度范围内。
DNA的Tm一般在82—95℃之间
2 影响DNA的Tm值的因素
① DNA均一性 。
均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。
② G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44
③ 介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
三 核酸的复性
复性分数 f = 1/1+kCot
Cot ½ 是指复性完成一半时的Cot值。
根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数
分子杂交
不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核 酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe） 通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例： southern印迹法
核糖核酸酶(RNase) 脱氧核糖核酸酶(DNase)
非特异性核酸酶
核酸内切酶 （2）根据切割位点分为 核酸外切酶
内切核酸酶对RNA的水解位点示意图
Py Pu Py Py G A C U G A
1´
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
OH
5´
3´
RNAase I RNAase I RNAase T1
RNAase T1
★ 含量计算
1 A260（OD260）值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸
★ 判断DNA是否变性
在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
二 核酸的变性
核酸的变性是指核酸受到加热、极端的pH或离子强度的降低等 因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成 单链的过程，其中并不涉及共价键断裂。
二 核酸的分离、纯化和定量
◇ 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 ◇ 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 ◇ 抑制核酸酶。
DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液 （1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl）， 据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开， 提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇 去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀
非专一性核酸酶类
外切核酸酶对核酸的水解位点
BBBBBBBB
5´ p
p
p
p
p
p
p
p
OH 3´
牛脾磷酸二酯酶
（ 5´端外切5得3）
蛇毒磷酸二酯酶
（ 3´端外切3得5）
可作用于RNA 或 DNA
第二节 核酸研究的技术和方法
一 DNA的化学合成：
合成方向：3’ → 5’端 5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3’-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护
★ 增色效应与减色效应
增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
1 Tm：熔解温度（melting temperature）
DNA 的 变 性 发 生 在一个很窄的温度 范围内，通常把热 变 性 过 程 中 A260 达 到最大值一半时的 温 度 称 为 该 DNA的 熔解温度，用Tm表 示。
Pu ：嘌呤
Py：嘧啶
限制性内切酶
原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基 对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序 列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类 酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。
限制性内切酶的命名和意义
在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢 复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的 功能恢复。
DNA的复性历程
★ 热变性DNA在缓慢冷却时可以 复性，快速冷却不能复性。
★ DNA片段越大，复性越慢； ★ DNA浓度越大，复性越快。 ★ 复性速度可用Cot衡量。
Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前） 的原始浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性 时间，以秒（s）表示。
第一节 核酸的性质
一 核酸的紫外吸收
DNA的紫外吸收光谱
1 天然DNA 2 变性DNA 3 核苷酸总吸收值
最大吸收峰为260 nm
3
0.
2
4
1
光 吸
0. 3
收
0.
2
0. 1
220 240 260 280
波长（nm）
核酸紫外吸收光谱的应用
★ 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
分子杂交的原理示意图
限制性酶切割
限制片段
琼脂糖电泳
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
四 核酸的水解
酸水解 碱水解 酶水解
核酸的酶水解
核酸酶的分类
（1）根据对底物的 专一性分为