小鼠成纤维细胞原代培养.docx
小鼠肾成纤维细胞使用说明
小鼠肾成纤维细胞小鼠肾成纤维细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠肾成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠肾成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
小鼠肾成纤维细胞注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠肾成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞：小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞小鼠肺大动脉内皮细胞小鼠前脂肪细胞小鼠肺动脉成纤维细胞小鼠成骨细胞小鼠肺大静脉内皮细胞小鼠关节软骨细胞小鼠气管和支气管上皮细胞小鼠胎儿表皮角质形成层细胞小鼠胰岛细胞小鼠成年表皮角质形成层细胞小鼠胰腺星状细胞小鼠皮下脂肪细胞小鼠胰腺导管上皮细胞小鼠内脏脂肪细胞小鼠颌下腺上皮细胞小鼠脑动脉血管内皮细胞小鼠腮腺细胞小鼠脑动脉血管平滑肌细胞小鼠乳腺上皮细胞小鼠脑静脉血管内皮细胞小鼠胰腺上皮细胞小鼠脑静脉血管平滑肌细胞小鼠甲状腺上皮细胞小鼠脑膜细胞小鼠淋巴管内皮细胞小鼠神经胶质细胞小鼠淋巴成纤维细胞小鼠海马神经元细胞小鼠外周血白细胞小鼠脑微血管内皮细胞小鼠骨髓基质细胞小鼠脑成纤维细胞小鼠食管上皮细胞小鼠神经小胶质细胞小鼠食管平滑肌细胞小鼠雪旺氏细胞小鼠肠动脉内皮细胞小鼠小脑颗粒细胞小鼠肠静脉内皮细胞小鼠嗅鞘细胞小鼠肝实质细胞小鼠视网膜微血管内皮细胞小鼠肝动脉内皮细胞小鼠小梁网细胞小鼠肝动脉平滑肌细胞小鼠视网膜色素上皮细胞小鼠小肠血管内皮细胞小鼠视网膜muller细胞小鼠小肠隐窝上皮细胞小鼠虹膜色素上皮细胞小鼠肝内胆管上皮细胞小鼠晶状体上皮细胞小鼠胃粘膜上皮细胞小鼠角膜上皮细胞小鼠肝窦内皮细胞小鼠视网膜神经节细胞小鼠肝星形细胞小鼠角膜成纤维细胞小鼠直肠平滑肌细胞小鼠脉络膜血管细胞小鼠小肠平滑肌细胞小鼠牙乳头细胞小鼠结肠平滑肌细胞小鼠肝外胆管上皮细胞小鼠肠上皮细胞小鼠肝Kupffer细胞小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞小鼠肠巨噬细胞小鼠下丘脑神经元细胞小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞小鼠卵巢颗粒细胞小鼠心肌微血管内皮细胞小鼠子宫颈上皮细胞小鼠真皮微血管上皮细胞小鼠子宫平滑肌细胞小鼠胚胎成纤维细胞小鼠卵巢上皮细胞小鼠心脏干细胞小鼠子宫成纤维细胞小鼠神经干细胞小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞小鼠肾系膜细胞小鼠肾足突细胞小鼠膀胱上皮细胞小鼠肾小管平滑肌细胞小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞小鼠肾动脉内皮细胞小鼠尿道上皮细胞小鼠肾动脉平滑肌细胞小鼠输尿管上皮细胞小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞小鼠血管外膜成纤维细胞。
小鼠尾尖成纤维细胞的分离与培养
不 仅 提供 完整 的遗传物 质 ， 而且培 养方便 ， 动物 的 对
生长 和繁 殖都无 影 响。本文 作者 以 鼠尾作 为 材料 探 讨一种 简单 有效 的体细胞 体外 培养 方法 。本 试验 是
Ｍ ｅ ｉ ｉ ｎ ，ｅ ｌ ｉＺｈ ｑ ａ ｇ ｔａ
Ｌｂ ｒ ｏ ｌ ｕａ ｉｌ ｙ Ｌ ｚｏ ｄｃｌ ０ｌｇ ａｏａ ｒ ｏ Ｍｏ ｃ ｌ Ｂ ｏ ｇ ，ｕｈ ｕＭｅ ｉ ｌ ｅ ｔｙｆ ｅ ｒ ｏ ａＣ ｅ பைடு நூலகம்ｂｔａ ｔ ０ｂ ｃｉ ：Ｔ ｓ ｂ ｓ ｉ ｌ ｍｅ ｏ ｏ ｏａ ｏ ｎ ｕｔｒ ｏ ｏ ｓ ａ —ｉ ｆ ｒｂａｔ ｓｒ ｃ ｊ ｔ ｅ ｏｅｔ ｌ ｈ ａｓ ｅ ｔ ｄｆｒｉ ｌ ｉｎａ ｄｃ ｌ ｅ ｆ ｕ ｅｔｉ ｔ ｂｏ ｌ ｓ． ｅ ｖ ａｉ ｍｐ ｈ ｓ ｔ ｕ ｍ ｌ ｐｉ ｓ
５ Ｃ ％ ０２； ｅ ｃ ｌ ｅ ｅ ｐ ｒ ｅ ｙ ｓ ｃ ｅ ｄｎ ｅ ｅ ａ ｉ ｎ ｔ — ｅ ｅ ａｉ ｎ ｃ ｌ ｒｎ ．Ｒｅ ｕｔ ｔ ｅｌ ｗ ｒ ｕ ｉ ｄ ｂ ｕ ｃ ｅ ｉ ｇ ｇ ｎ ｒ ｔ － ｏ ｇ ｎ ｒ ｔ ｕ ｔ ｉ ｇ ｈ ｓ ｉ ｆ ｏ ｏ ｕ ｓ ｌ ｓ：Ｔ ｅ ｃ ｌ ｒｄ ｃ ｌ ｈ ｕ ｔ ｅ ｅｌ ｕ ｓ
１％胎 牛 血清 ） 养基 进 行培 养 ， 通 过 传 代得 到 纯 化 的 成 纤 维 细胞 。 结 果 ： 代 培 养 的 成纤 维 细胞 特 征 典 型 ， 通 过传 代 培 养 ０ 培 并 原 并
得 到 了 纯 化 的成 纤 维细 胞 。 结论 ： 采用 组 织块 培 养 法 成 功 地 培 养 了成 纤 维 细胞 ， 法 简单 ， 物 细 胞 核 移植 、 基 因等 提供 核 方 为动 转
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养
小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养张 怡1 赵连三1△ 汪成孝2 雷秉钧11.四川大学华西医院传染科(成都610041);2.四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 【摘要】 目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞(M EF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的M EF培养体系。
方法 取BA L B/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对M EF的生长形态、生长曲线及细胞周期进行观察,并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对M EF分离及培养的影响进行研究。
结果 13.5d胎龄鼠胚的M EF 分离效果优于10.5d、18.5d胎龄鼠胚;M EF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下,0. 25%胰酶消化M EF时间以3～5min为宜。
结论 M EF在第3代增殖旺盛,最适宜作胚胎干细胞的饲养层。
【关键词】 小鼠胚胎成纤维细胞 胚胎干细胞 饲养层【中图分类号】 R329.2Isolation and Culture of Mouse Embryonic Fibroblast Z ha ng Yi*,Zhao Lia nsa n,Wa ng Che ng x ia o,Le i Bing jun.*T he I nf ectious D iseas es D ep ar tment,W est China H osp ital,Sichuan University,Cheng du610041,China 【Abstract】 Obj ective T o establish a stable cult ur e system o f mouse embry onic fibr obla st(M EF).Methods We isolated M EF fr o m t he embry os of BAL B/c mouse and investig ated t he mo rpholog y,g r ow th cur ve and cell cycle of M EF in v itr o.T he effects of the gestational ag e(days)o f mo use embr yo s and the time o f dig estio n o n the isolation and culture o f M EF w ere assessed.Results T he mo use em br yo of13.5d is better than that of10.5d and18.5d o n the iso lat ion o f M EF.M EF in vitro is a kind of a dher ent cell w ith g oo d a bility fo r pr olifer ation in passag e3.In ro om t emper atur e,the digestive time o f0.25%t ry psin should be3-5min.Conclusion M EFs(P3) ar e quite suited to be a feeder lay er o f embry onic stem cells.【Key words】 M ouse em br yo nic fibro blast Embr yo nic stem cells F eeder layer 胚胎干细胞(em bry onic stem cells,ES细胞)是指来源于着床前囊胚内细胞团或早期胎儿原始生殖细胞的一类未分化的全能性细胞,具有无限增殖和全能分化的潜力[1,2]。
成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性
doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2017.06.021研究报告成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性陈雪梅a，薛斯亮b，吴思思a四川大学华西医院a.公共实验技术中心；b.皮肤性病科；四川成都610041［摘要］目的：建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法，并探索其生物学特性。
方法：取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤，配制2种血清的细胞培养液，采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养，通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度；通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。
结果：背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7d无细胞游出，CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。
背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少；经组织块贴壁法细胞生长慢，培养周期长；酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。
尾尖取材量少，得到细胞少；耳部皮肤取材方便，但细胞纯度低。
CCK8增殖曲线呈S型；相较于对照组，UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。
结论：CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案，可增加细胞得量、缩短培养周期，降低成本。
［关键词］成年小鼠；原代皮肤成纤维细胞；酶消化法；组织块贴壁法［中图分类号］Q813.1［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2017）06-0823-05 Separation and Biological Characteristics of Primary Skin Fibroblasts from Adult Mice SkinCHEN Xue-Mei a,XUE Si-Liang b,WU Si-Si a*a.Core Facility;b.Dermatology＆STD;West China Hospital,Sichuan University,Chengdu610041,China*Corresponding author,E-mail:949189109@［Abstract］Objective:To establish time and cost saved method for culturing adult mice primary skin fibro⁃blasts,and to explore its biological characteristics by immunofluorescence assay.Methods:The back skin,tail tip skin and ear skin were striping from adult mice（8~12weeks）,we chose two different DMEM high glucose ex⁃tracts,three methods including tissue adherence method,enzyme digestion method and enzyme digestion tissue ad⁃herence method to culture adult mice primary skin fibroblasts.Evaluate those methods by microscopic observation through the cell numbers,the cell status,the length of culture cycle and cells'purity.The biological characteris⁃tics of the cells were identified by immunofluorescence,CCK-8and flow cytometry.Results:When using tissue adherent method to culture primary fibroblasts of adult mice's back skin,the Gibco fetal bovine serum（FBS）has little cell migrate out,the CLARK FBS has much more cell migration.The back skin was chosen to compare the different culture methods.When using enzyme digestion method,a very small amount cells were received and it has a terrible status,the tissue adherence method can provide more cells,but it took long time for the primary 收稿日期：2017-06-27基金项目：青年科学基金（81502747）作者简介：陈雪梅（1990-），女，学士，助理实验师，（E-mail）731078695@通信作者：吴思思，（E-mail）949189109@cell to migrate out.The method combining the enzyme digestion and tissue adherence can provide more cells and shorten the culture cycle.About the purity of cells,back skin was higher than that of the tail tip skin,the tail tip skin was higher than the ear skin.The proliferation curve of primary skin fibroblasts was presented a typical "S"pared with the control group,UVB irradiation increased the apoptosis rate by17%.Conclusion: The optimal method for primary skin fibroblasts culture is the Clark grade fetal bovine serum total extracts,adult mice back skin extraction,and enzyme digestion tissue adherence method.This combination can provide a large number of cells,shorten the culture cycle,reduce the cost.［Key words］adult mice;primary skin fibroblasts;enzyme digestion method;tissue adherence method皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，成纤维细胞是真皮层主要构成细胞，能促进表皮细胞迁移、增殖和分化，分泌大量胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，是皮肤组织受损或衰老后的主要修复细胞[1-2]。
原代培养
原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。
(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。
900rpm离心2min。
(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。
、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。
置37℃ 5%CO2培养箱中培养。
、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。
此后每周以此液半量换液2次。
培养8-10天进行下一步实验。
投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。
1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。
2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。
3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。
用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养赵进军;胡子有;欧阳晴晴;毋静;陈玉姣;杨敏【摘要】Objective The primary culture of synovial fibroblasts is a convenient tool to study the pathology and physiology of synovialtissues .An improved method was constructed in this study by C57BL /6 mice to study the mechanism of rheumatoid ar-thritis(RA) .Methods The synovium around the hip joints were collected .Attention should be paid to eliminate the "egg-yolk" like yellow oval substance in the middle of the synovium .The synovium was transferred into a 1 .5 mL Eppendorf tube containing 0 .5%type Ⅳ collagenase and cut into 1 mm3 blocks or so .The Eppendorf tube was placed in 37 ℃ Constant temperature orbital shaker incubator for 60 min .After digestion ,the tube was placed on the Vortexfor a high-speed oscillation for 1 .5 minutes to guarantee the separation of cells .Results Within about 1 week ,the first passage was performed by the trypsin digestion method .On day 10 , the number of synovial macrophages reached the maximum and then decreased gradually .After the third generation (day 15 to 20) , the synovial macrophages generally disappeared .Vimentin was suitable for the immunofluorescence cytochemical staining for the synovial fibroblasts .The cell purity was indicated as > 95% .The cytometric analysis indicated that purity of Vimentin and CD90 .2-labelled cells was over 95% ;the purity of CD54-labelled cells was 80% approximately .Conclusion It is a simple and effective method for primary culture of synovial fibroblasts in mice .%目的：利用 C57BL ／6小鼠探索出一种改良的小鼠滑膜成纤维细胞（SF）的原代培养方法，以方便类风湿关节炎（RA）关于滑膜炎的研究。
小鼠真皮成纤维细胞使用说明
小鼠真皮成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠真皮成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠真皮成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠真皮成纤维细胞产品简介：1、产品名称：小鼠真皮成纤维细胞（Mouse dermal fibroblast cells）2、组织来源：小鼠乳鼠背部皮肤组织3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠真皮成纤维细胞简介：真皮成纤维样细胞是真皮组织的源细胞，是创面愈合的主要修复细胞。
该细胞的体外分离、培养、诱导、分化，是创面修复的相关研究的关键之处。
本公司生产的小鼠真皮成纤维样细胞采用混合酶消化制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠真皮成纤维细胞培养基信息：1）培养基类型：成纤维样细胞专用培养基2）添加因子：FBS、Penicillin、Streptomycin 等小鼠真皮成纤维细胞使用方法：细胞培1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定
鼠皮 肤分 离 培养 成 纤维 细胞 ， 建立 肿瘤 体 外模 拟 微环 境 提供 实 验材 料 和研 究基 础 。 为
【 键 词１ 生 小 鼠 ； 纤维 细胞 ； 外 培 养 ； 形蛋 白 关 新 成 体 波
【 中图分 类 号１ ３ ２ １ ９． Ｒ 【 文献 标 识码 】Ａ 【 章编 号】 １ ３ ７ １ ２ １ ）０（ 一 ０ — ４
１Ｄ ｐ ｒ ｎ ｆＲｅｐｒｔｒ ｄｃｎ ，ｔｅ ＦｒｔＡ ｆｉｔｄ Ｈｏｐｔｌｏ ｉｍｅ ｎｖ ｒｉ ，Ｆ ｊ ｎ Ｐｏ ｉｃ，Ｘｉｍ ｎ ． ｅ ａｔ ｔ ｏ ｓｉ ｏｙ Ｍｅｉｉｅ ｈ ｉ ｆｌ ｅ ｓ ｉ ｆＸ ａ ｎ Ｕ ｉｅ ｔ ｕｉ ｒｖｎ ｅ ｍｅ ａ ｓ ｉａ ａ ｓ ｙ ａ ａ ｅ ３ １ ０ ， ｈｎ ； ． ｐ ｒ ｎ ｆＩ ｍｕ ｏｏｙ Ｂ ｓ ｄｃ ｅＳ ｉ ｃ ｎｔｅＭｅ ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉｍｅ ｎｖｒｉ ， ｕｉ ６ ０ ３ Ｃ ｉａ ２Ｄｅ ａｔ ｔ ｍｅ ｏ ｍ ｎ ｌｇ， ａｉ Ｍｅ ｉｉ ｃ ｎ ｅｉ ｄｃｌ ｏ ｅ ｅｏ ａ ｎＵ ｉｅ ｔ Ｆ ｊ ｎ ｃ ｎ ｅ ｈ ｌ Ｘ ｓ ｙ ａ
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小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
IRM_2小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和生物学特性
5 % CO 2、 饱和湿度培养箱培养, 第 2 天全量换液 , 待 细胞生长至融合即可传代。 1 . 2 . 2 MEF的传代纯化和冻存 底 80 % ~ 90 % 时消化传代 , 加入 0 . 25 % 的胰蛋白酶 37 ! 消化 2 m in , 成纤维细胞缩成球形, 而上皮细胞 仍维持原状, 从而将成纤 维细胞与上皮 细胞分离。 传代过程中尽量保持细胞处于高密度生长 , 即传代 比例不超过 1 胞培养。 1 . 2 . 3 M EF 生长曲线 测定
3
3 。 MEF 继续培养和冻存同常规细
M EF 以 2 ∀ 10 /孔 的细胞密 度接种于 24 孔细胞培 养板, 置 37! 、 5 % CO2 培养箱中培养, 每隔 3 d 换液 1 次。每天同一时间点取 3孔用台盼蓝染色计数活
苏州大学学报 ( 医学版 ) 2010 ; 30 ( 1)
3
处于 活 跃 的 增 殖 期 ( S 期 ) ( 分 别 为 25 . 8 % 和 21. 2 % ) , 处于 G 2 /M 期的细胞比例 分别为 27 . 1 %
分离 I RM 2 小鼠 M EFs, 并进行原代培养和传代培 养。观察 M EF s 生长 形态 , 测定第 3 代和第 5 代细胞 生长曲
线、 细胞周期和增殖指数。 结果
胞 , 6 代前 M EF s生长良好。第 3 代和第 5 代 M EF s在培养至第 3 天开始进入对数生长期 , 到第 6 天时细胞数达到高 峰。 M EFs 增殖 活跃 , 第 3 代 和第 5 代细 胞增 殖指 数分 别为 53% 和 46% 。 结 论 M EF s , 为进一步利用 M EF s 研究小鼠的辐射抗性机制奠定了基础。 关键词 : 小鼠胚胎成纤维细胞 ; I RM 2 小鼠 ; 原代培养 中图分类号 : R329. 2+ 4 文献标识 码 : A 文章编号 : 1673- 0399( 2010) 01- 0001- 03
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养一、实验材料1．主要仪器设备倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2．试剂RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶3．实验动物孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤1. 获取小鼠胚胎(1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上(2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。
(3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。
将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。
(4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。
(5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。
(6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。
(7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成约1 mm3以下的碎块。
(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。
(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。
(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。
(5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作
环节是在增殖的同时保持其未分化状态。"#;" 年
［ ?］ ［ +］ VZ0/8 等 和 20.95/ 等 分别利用成纤维细胞饲养
层的培养系统，首次成功建立了小鼠胚胎干细胞
［ \， ;］ 系。成纤维细胞可以合成分泌多种因子 ， 其中
白血病抑制因子 （ &3-]3C50 5/F5U59%.R 1069%.，E<W ）和 成纤维细胞生长因子 （ 15U.%U&089 :.%X9F 1069%.，WQW ）
$%&’ "#! (%’ " ,0/’ )**+
!"# 小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作
招! 霞， ! 孙海翔， ! 胡娅莉， ! 张宁媛， ! 徐志鹏
（ 南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心， 江苏南京 )"***; ）
摘要： ! 目的： 建立 <=> 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系， 用于胚胎干细胞建系及研究。 ! 方法： 选取不同胎 以细胞形态、 生长曲线、 囊胚种植 龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞， 制作饲养层， 使用不同浓度丝裂霉素 = 处理， 情况为饲养层评价指标。! 结果： <=> 小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄 ")’ ? @ "A’ ? 4 进行原代细胞分离； ")’ ? 4 为最 "B’ ? 和 "A’ ? 4 分离的细胞需在 B 代以后使用； + 代以前细胞可用于饲养层制作；)* C: D E 丝裂霉素 = 佳分离时间； 作用 )’ ? F 可达到较好的处理效果。! 结论： <=> 小鼠可用来分离、 培养胚胎成纤维细胞， 用于胚胎干细胞饲养层 的制作。 ! 胚胎成纤维细胞； ! <=> 小鼠； ! 饲养层； ! 胚胎干细胞 关键词： ! >GBB)! ! ! 文献标识码： ! H! ! ! 文章编号： ! "**;G;"## （ )**+ ） *"G**B+G*A ! 中图分类号：
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠成纤维细胞原代培养启示和收获
小鼠成纤维细胞原代培养启示和收获
小鼠成纤维细胞原代培养的启示和收获有：
- 培养细胞刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层，一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。
- 可应用于细胞保种、分子生物学研究和基因治疗相关研究。
小鼠成纤维细胞原代培养可以为生物学研究提供丰富的细胞来源，同时也可以为细胞保种提供支持。
在进行小鼠成纤维细胞原代培养时，需要注意细胞的生长环境和条件，以确保培养的细胞具有良好的生物学特性。
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实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2 •熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3•了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
该方法主要使用生物化学手段将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。
胰蛋白酶主要适用于一些间质少、较软的组织如上皮、肝、肾和胚胎等，胶原酶主要适用于纤维组织、一些较硬的癌组织等的消化中。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，细胞保持原有细胞的基本性质，生物性状尚未发生很大变化，一定程度上更接近于生物体内的生活状态，可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
2 •传代培养（SUbCUltUre ）是原代培养细胞或细胞株在体外获得稳定大量同种细胞并维持细胞种延续的过程。
当原代培养成功后，培养的细胞通过增殖达到一定数量后，必需对细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种于新的培养瓶中，这一过程即为传代培养，亦称为继代培养或连续培养。
如果原代细胞是正常细胞，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，形成的单层细胞汇合，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另外，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，加之代谢物积累也不利于细胞生长或发生中毒。
此时，就需要将将培养细胞从原培养器中取出，加以分离，以1 : 2或1 : 3以上比率转移到另外培养器皿（瓶）内扩大培养，此过程称为传代（PaSSage）。
原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。
细胞传代后一般经三个阶段：游离期；指数增生期和停止期。
培养细胞的“一代”是指传代培养的累积次数，其与细胞世代或倍增不同，细胞转移扩大培养的1代中，细胞约能倍增3〜6次。
细胞增殖的旺盛程度通常用细胞分裂指数表示，即细胞群的分裂相数/ 100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2 %〜0.5 %,肿瘤细胞可达3〜5%。
细胞接种2〜3d时分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期（对数生长期），适宜进行各种试验。
体外培养细胞和生长类型不同，传代培养的方法也不同。
贴附型生长的细胞要先进行消化，制成细胞悬液再传代；而悬浮型生长的细胞可直接传代，或离心后传代。
3 •细胞活力测定：在标准化培养和实验条件下，细胞数目及活力测定极其重要。
1983年MoSmanr首次应用MTT比色法检测培养细胞活力。
MTT的化学名称为3- （4, 5-二甲基噻唑-2 ）-2 , 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。
其具有接受氢原子而发生显色反应。
检测原理为，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢，脱下的J通过受氢体传递，能使外源性染料MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中。
细胞中的蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜（DMSO中，并表现为一定的色度。
用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，并根据光吸收值的高低判断活细胞数量。
在一定细胞数范围内，光吸收值与活细胞数成正比。
死细胞内酶失去活性，故无此功能。
该检测方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济安全，具有良好的相关性。
广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
三.实验物品1. 材料：乳鼠、、HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
荒2•器材：超净工作台、解剖器材、酒精灯、离心管、移液管、吸管、烧杯、大平皿、96孔培养板、不锈钢滤网（100目、200目）、水浴箱、血细胞计数板、培养瓶、CO培养箱、离心机、盖玻片，擦镜纸，香柏油、倒置相差显微镜、显微镜、全自动酶标仪（bio-rad550 型）。
3. 试剂:（1）75%乙醇（2）PBS液（pH7.2）配方：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g 调PH 7.4 定容1L（3）无钙、镁离子PBS液（4）D-HanK液（无钙、镁离子的HanK液）（5）消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）（6）0.25 %胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶0.25g、D-Hanks 液100ml,pH7.4 ）（7）0.4%台盼蓝、（8）培养液：EMEM培养液（Eagle' S Minimum ESSential MediUm Eagle 氏最低要求培养基）：EMEM85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100 ng/ml。
EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除茵。
4 C冰箱贮存。
DMEM （DUIbeCCO ' S MOdifiCatiOn of Eagle ' S MedliUmRPMI1640培养液（90%RPMI 1640、10%胎牛血清、双抗（青霉素，链霉素）100单位/ml7.4%NaHCO3 调PH 至6.8〜7.0）RPMI1640维持液（5%胎牛血清、余同上）（9）0.5%MTT 溶液（5mg∕ml ）、MTT0.5g ,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS ,用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4C避光保存两周内有效。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
最好现用现配。
（10）二甲基亚砜（11）碘伏四.实验步骤原代培养组织块培养法：1 •动物处死取新生大鼠（出生2〜3天）一只，用颈椎脱臼法处死；为避免过多血细胞的干扰，也可采用剪断颈动脉放血的方法处死。
然后，把新生大鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中2-3秒，取出后放在大平皿中携入超净工作台。
2•取材用碘酒和75%乙醇再次消毒一次，打开消毒器械包用镊子新生大鼠腹部皮肤，用解剖剪开腹腔，充分暴露腹腔；用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏（右肾略低）；取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中。
（或取出肝组织置于培养皿中。
）3•剪切剪开肾膜，剥向肾门，去除肾膜及脂肪；用吸管吸取灭菌PBS （或Hanks液）将肾脏清洗3次，去除血污；将肾脏移入另一平皿中，沿纵轴剪开肾脏，剪去肾盂，用眼科剪将肾组织反复剪碎，直到剪成0.5〜1mm组织块；用吸管加2〜3滴培养液轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。
（或肝组织用HankS液反复冲洗，以除去血细胞，将肝组织移入另一个培养皿中，用吸管吸取0.5ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成0.5〜1mm组织块。
）4 •接种：用弯头吸管小心分次吸取组织块，使组织块吸在吸管端部，要避免吸得过高，组织块粘附于吸管壁而丢失。
将组织块均匀排布在培养瓶底部，控制组织块间距在0.5cm 左右，每—25ml培养瓶底可摆布15〜20块。
轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，翻瓶时勿使组织块流动，加入2〜3ml培养液（液层厚约15mm ,塞好瓶塞，置CO培养箱37 C培养2〜3h,（勿超过4h）。
此时组织块略干燥，能贴附于瓶壁上。
5.培养：慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡附于瓶底的组织块，置培养箱中静止培养。
操作过程中动作一定要轻，减少振动，使培养液慢慢覆盖组织块，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。
6•观察24小时后取出观察，移动培养瓶时要尽量使培养液震荡撞击组织块。
在显微镜下观察已贴壁的组织块有无细胞长出。
消化培养法1. 处死动物、取材及剪切：与组织块培养法相同。
剪切后的组织块再用灭菌的PBS（或HankS液）清洗数次，直到PBS澄清为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉到管底，弃上清。
2. 消化及分散组织块按组织块体积5〜10倍量，吸取0.25 %胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液加到含组织块的无菌离心管中，与组织块混匀后，加盖无菌塞子密封，置37 C 水浴中消化10〜20min ,其间每5min摇动一次，使组织块散开并与消化液充分接触。
当组织块变得疏松、颜色略白时，从水浴中取出离心管，在超净工作台内静置后吸去含胰蛋白酶的上清（此步骤可以在800〜100OrPm离心3〜5min去除含胰蛋白酶的上清），加入2〜3ml培养液，终止消化。
用吸管反复吹打，直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止。
最后将此细胞悬液用100目、200目的不锈钢滤网过滤至烧杯中。
3计数及稀释：从过滤的细胞悬液中取1ml ,用血细胞计数板计数。
根据计数结果，用培养液稀释，稀释后的细胞密度以5× 105〜1 × 106为宜。
4. 接种培养：将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，一般25ml小方瓶分装4〜5ml,青霉素瓶分装1ml。
培养瓶上做好标记，培养瓶盖旋紧后再松半个螺旋，置CQ培养箱在37 C培养。