膜片钳实验与技术

◦非门控离子通道 ◦门控离子通道 ◦电压门控性通道 ◦化学门控性通道 ◦机械门控性通道
1、非门控性离子通道
有些离子通道始终处于开放状态，离子可随时进出细胞， 并不受外界信号的明显影响，这些通道称为非门控离子通道。 如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许 K+自由进出细胞，而引起的K+电化学平衡电位，此种K+通道即 属于非门控性离子通道。
2、膜片钳技术 1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50MΩ的封接，首次 记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流，为证实生物膜离子单通道 是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。但是，当时 实验记录的背景噪声较大。1980年，Neher利用负压吸引实现了GΩ 封接，背景噪声显著减低。1991年膜片钳技术的创始人Neher和 Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。
（3）处理 微电极拉制成功后，其尖端需进一步处理。这一过程包括涂硅酮 树酯（sylgard coating）和热抛光（heat polish）。前者是将硅酮树酯涂于微 电极尖端以外部分，达到使浸入浴液中的微电极表面呈疏水性，减小电极内部 与溶液之间的电容。
热抛光是在显微镜下，将微电极尖端接近热源（通电加热的铂丝或白金丝 等），使电极尖端表面变得更加宽阔和光滑，经热抛光处理的微电极可使高阻 封接的成功率明显提高。
然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者当时还
不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发表20年 来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了一万二
千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来还在以
平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是由
Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于 1981年发表在《欧洲生理学杂志》上的著名论文
（2）拉制 膜片钳实验用微电极与细胞外记录和细胞内记录用微电极不 同，其尖端较短，锥度较大，尖端直径为1~5μm，充灌林格氏液时阻抗 约1~5MΩ，因此一般采用两步拉制法。第一步将玻璃软化，拉出一个 长7~10mm、直径200~400μm的杆，第二步再从杆中央以较小电流拉 出两根尖端锥度较大的微电极。
乙酰胆碱门控离子通道
由α1γα2βδ 五个亚基组成，呈五边形排列。每个亚基有 4个跨膜区段即M1~4，由五个亚基的M2共同构成孔道的内壁。在 α1和α2亚基N端的细胞外部分各有一个ACh结合位点，当两个 ACh分子与α亚基结合后，便引起通道蛋白的构象变化和通道开 放，主要引起Na+内流增多。
三、离子通道的分类
Patch clamp
Erwin Neher 1944~
Bert Sakmann 1942~
膜片钳技术是用尖端直径1~2μm的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处 理干净的细胞膜接触，通过20~30cm H2O的负压吸引造成电极尖端与 细胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使电极尖端下的小块膜片与膜的 其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个μm2膜 片上1~3个离子通道活动的方法。 膜片钳技术可用一根玻璃微电极同时 完成膜片（或全细胞）电位的监测、钳制及通道电流的记录。
经纯化、克隆和测定表明，离子通道蛋白 是由多个亚基构成的复合体。电压门控离子 通道由α、β、γ、δ等亚基构成，但不同 的离子通道的组成略有差异，如钠通道由α、 β1 、 β2和β3 、 β4亚基组成，钙通道由α1、 α2、β、γ和δ亚基组成，钾通道由α和β 亚基组成等。在各亚基中，α亚基是构成离 子通道的主要功能单位，而其它亚基则只起 调节作用。
目录
一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法 六、膜片钳改良模式及其它研究方法
一、离子通道的概念
离子通道（ion channels）是镶嵌在细胞膜脂 质双分子层上的一种 特殊整合蛋白，在特 定情况下，形成具有 高度选择性的亲水性 孔道，允许适当大小 和电荷的离子以被动 转运的方式通过。
离子通道具有两大共同特征，即离子选择性及门控特性。选择 性包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性，如安静时神经细胞膜
离子通道对K+的通透性比Na+大100倍，而神经兴奋时，对Na+通透
性又比K+大10~20倍。通道闸门的开启和关闭过程称为门控 （gating）。通道可表现为三种状态，即备用、激活及失活状态。
除5上、述其离子它通道门外，控尚发离现子具有通其它道门控特性的离子通道存在，
如细胞容积敏感的钾通道（Kvo l）在细胞肿胀时通道开放；Na+激活 钾通道（KNa）对电压、细胞内ATP浓度及细胞内钙均不敏感，只有 细胞内Na+浓度升高到20mmol/L以上时开放；存在于多种肌细胞的 静息活化钙通道，在没有电压、化学或机械刺激时，参与静息钙内流， 调制静息时的细胞内钙浓度。
２．化学门控离子通道的基本结构
当各种化学物质与化学门控离子通道相应部位结合后，会导致 通道蛋白发生构型变化，引起通道开放，产生离子电流。体内这种离 子通道的种类很多，主要包括各种神经递质门控离子通道、ATP敏感 钾通道和钙依赖性钾通道等。
神经递质门控离子通道又称为离子通道受体，主要有乙酰胆碱门 控离子通道、GABA门控离子通道及谷氨酸门控离了通道三大类。
膜片钳实验方法包括：
◦ 微电极的制备 ◦ 细胞标本的制备 ◦ 高阻封接的形成 ◦ 离子单通道电流的记录或全细胞记录
1、微电极的制备
微电极是用拉制器由玻璃毛细管拉制而成。玻璃微电极的选材 和拉制质量直接影响封接电阻及记录时的噪声大小。
（1）选材 膜片钳实验用微电极可根据不同记录模式选用不同的玻 璃毛细管拉制。从玻璃毛细管材料方面,可分为软质玻璃和硬质玻璃 两类。
膜片钳技术具有1pA的电流分辨率，10 μs的时间分辨率和1 μm2 的空间 分辨率，使其成为在活体细胞上进行电生理学研究的重要手段。
随着该技术的逐渐完善及应用，目前已成为从功能角度探讨各种生理、 病理生理及药物作用机制最直接、最理想的电生理学研究方法，也为多学 科探讨生命活动规律、疾病与转归机理及药物作用等细胞和分子水平的研 究，开辟了广泛前景。
钠离子通道（sodium channels，简称钠通道），是选择性 地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素 （tetrodotoxin, TTX）和μ-食鱼螺毒素（μ-conotoxin,μ- CTX） 的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。
电压门控钙离子通道
钙离子通道（calcium channels，简称钙通道）是选择性容许 Ca2+跨膜通过的离子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道 对膜电位变化的敏感性，将神经元质膜电压门控钙离子通道分为T、 L及N三种类型，后来应用不同的毒素阻断钙电流的某种特定的成分， 在神经元又增加了P、Q和R型，共6型。
3、膜片钳记录的模式
根据研究需要及记录膜片的不同，膜片钳记录可形成以下四种基本模式 1.细胞贴附式（cell attached patch） 2.内面向外式（inside-out patch） 3.外面向外式（outside-out patch） 4.全细胞记录式（whole cell recording）
二、离子通道的分子结构
随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术 的应用，特别是膜片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达 等技术的结合，使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平， 人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子 通道的孔道特性。
１．电压门控离子通道的基本结构
4、膜片钳实验系统的组建
膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其 基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频 监视器以及防震台和屏蔽罩等。
视频监 视器
温度控 制系统
倒置显 微镜
探 头
微操纵 器
模数转 换器
计算及分 析软件
五、膜片钳实验方法
2、电压门控离子通道
电压门控离子通道（voltage-gated ion channels）又称电压依赖性离子通道，这 一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决 定，具有电压依赖性和时间依赖性。电压 门控离子通道一般以最容易通过的离子命 名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子 通道等。
电压门控钠离子通道
当膜去极化时，每一个功能区的S4肽段做螺旋运动而使正电荷移 出产生微弱而短暂的门控电流，导致通道构象变化。当四个结构域S4肽 段均发生这种构象变化时，则通道便处于激活开放状态，因此，S4肽段 又称为激活闸门（activation gate, m闸门）在通道开放后，很快Ⅲ结构 域门的）S，6与形Ⅳ成功一能“区活的瓣S”1之，间将的通肽道链内构口成阻失塞活，闸调门控（通in道ac的tiv失at活io过n g程at。e, h闸
四、离子通道的研究技术
1、电压钳技术 电压钳技术是1949年Cole及Marmont设计的，后经Hodgkin、 Huxley 和Katz等加以改进，并成功地应用于枪乌贼巨轴突动作电位 期间离子电流的研究。
他们直接测定了膜电流并分析了电流的离子成分，推算出动作电位 期间钠电导和钾电导的变化，其基本概念至今仍被沿用。鉴于 Hodgkin、Huxley 和Eccles
门控通道（ligand gated channels）。这一类通道的门控行为主要受 其相应配体的控制，配体是包括神经递质、激素等各种激动剂和阻 滞剂在内的多种化学因素。当激动剂与化学门控离子通道结合后， 会引起通道蛋白构型变化，导致通道开放，产生离子电流。
4、机械门控离子通道
机械门控离子通道（mechanically gated ion channels）是由 机械牵拉激活的离子通道，主要见于触觉和听觉感受器，如声波传 入内耳后，引起内耳毛细胞顶端纤毛发生弯曲或偏斜，从而使毛细 胞顶端机械门控通道开放，阳离子内流产生听觉的感受电位。