细菌染色体DNA的提纯与纯化
DNA和RNA提取方法及原理
材料准备
基因组DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集
核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组dna时要选择有核细胞白细胞组培细胞培养时间不能过长否则会造成dna降解含病毒的液体材料dna含量较少提取前先富集基因组dna的提取质粒dna的提取使用处于对数期的新鲜菌体老化菌体导致开环质粒增加培养时应加入筛选压力否则菌体易污染质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒如为低拷贝或大质粒则应加大菌体用量菌株不要频繁转接质粒丢失细胞裂解细胞裂解材料应适量过多会影响裂解导致dna量少纯度低针对不同材料选择适当的裂解预处理方式
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
DNA提取方法范文
DNA提取方法范文
材料和仪器：
1.细胞样品（例如细菌、动植物组织）
2. lysis缓冲液（含有蛋白酶、盐、缓冲液等成分）
3.蛋白酶K
4.乙酸混合酚
5.氯仿-异戊醇
6. 同济 Pharmacia GenePure Kit
7.离心管及离心机
8.PCR反应管
9.热水浴
步骤：
1. 取细胞样品加入适量的l 管内，混匀后用200L蛋白酶K
（10mg/Lysis）进行蛋白酶作用，37℃恒温2小时，期间翻转混匀。
2. 加入200L 10mg/ml 乙醚/酚搅匀，室温6分钟。
4.在热水浴中加入异戊醇至70°，10分钟，室温离心后去异戊醇。
5.加入75%乙醇冷冻纯化。
6.给乙醇沫体V100V1/50V离心处理梦泪水，禾端。
7. 加入便直完成cent and Over night 28°。
本方法主要通过蛋白酶作用和有机溶剂的使用来破坏细胞膜和蛋白质，最终得到DNA。
蛋白酶K能够将蛋白质降解，使得DNA得以释放出来。
乙
醚/酚和氯仿-异戊醇的使用则有助于分离DNA、RNA和蛋白质，最终得到
高纯度的DNA。
在DNA提取的过程中，要注意避免DNA受到外界污染，可以在操作台
上使用紫外灯杀菌消毒，同时使用无菌技术进行操作。
此外，选用高质量
的试剂和耗材也是保证实验成功的重要因素。
细菌基因组DNA的提取
四、注意事项——核酸分离、纯化
四、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
原因
02
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融
01
小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。
02
小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µl 70％乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50µlTE （含20µg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置备用。
核酸制备的步骤： 破碎细胞
01
一、实验原理
核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
基因工程常规技术-核酸提取纯化
19
原理：
在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然 后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱 下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、 转化转染等分子生物学下游实验。
20
天根生化质粒提取试剂盒提取流程
21
22
影响质粒DNA产量的因素
最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
54
五、DNA分子量的估计
一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA 标准混合液对比得知。 DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常 方便。如 DNA的Hind Ⅲ酶切物等。
Marker
Marker
55
DNA Marker 28kb 20kb 5000bp 2500bp 2300bp 1300bp 900bp 750bp 200bp
13
⑦ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼 酸缓冲液），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
14
⑨ 酚-氯仿
选用
留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因
此在这一步得到了去除。
31
32
33
2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提
一般过程及原理： （1）组织粉碎
动物组织剪成小块，匀浆或置液氮中冻结后
研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。
34
（2）细胞裂解
0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可以 使细胞膜崩解。
DNA提取方法和试剂作用汇总
1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
2 DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。
方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。
利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。
加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。
将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。
另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。
DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
微生物分子生物学技术
一、质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳（一）碱变性法提取质粒DNA质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。
带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。
将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。
质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。
分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解; 质粒DNA的提取与纯化。
本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。
【原理】细菌培养物加入SDS和NaOH 碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA 一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。
用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。
根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。
【材料】1．菌株E.coli JM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322）2．试剂溶液Ⅰ( 50 mM葡萄糖, 25 mM Tris.Hcl PH 8.0, 10 mM EDTA)溶液II ( 0.2 N NaOH，1%SDS) 用前新配制溶液III ( 5 mM KAc溶液PH4.8)TE缓冲液(10mMTris.Hcl ,1mMEDTA PH8.0)LB液体培养基( 胰蛋白胨10g,，酵母粉5g, Nacl 10g. 加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.5，加水至1000 ml,15磅高压灭菌15分钟)。
【方法】1．接种细菌于5ml LB液体培养基中，370C培养过夜。
2．3000 rpm/min,离心15min，弃上清。
加入100ul 溶液1悬起细菌沉淀。
3．加入200ul前新配制的溶液II ，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。
4．加入150ul溶液III温和地混匀，12000 rpm/min,离心5min。
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测讲解学习
质粒D N A的提取、纯化和电泳检测质粒DNA的提取、纯化和电泳检测姓名学号同组人班级实验时间摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。
质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。
凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
本次实验利用碱变法对E.coli DH5 受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。
通过此次实验，我们达到了预期效果。
关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA 凝胶电泳1.引言质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。
细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。
一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。
由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。
质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。
近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。
因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术
细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【摘要】试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial charomosome,BAc)文库的构建奠定基础.以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的Hind Ⅲ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切.结果表明,Hind Ⅲ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL).该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC 文库的构建.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)005【总页数】4页(P79-82)【关键词】细菌人工染色体;基因组DNA;限制性内切酶;酶切【作者】陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子,832003;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;石河子大学生命科学学院,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q343.2基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞核DNA的大部分或全部片段随机连接到克隆载体上,再转移至适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段无性繁殖系的总集,是含有某种生物全部或大部分随机片段的重组DNA克隆群体,又称为人工构建的“基因银行”(gene bank)。
BAC文库的建立,为今后的基因组学的研究提供了一个强有力的技术平台(Zhang等,1996),也成为图位克隆基因(景润春等,2000)、基因组物理作图(Tao等,2001)、基因组测序(Cayanis等,1998)、基因组组织结构分析、一些特殊基因组序列(Alu,SSR)简单筛选及基因表达调控和基因转化等研究的重要资源。
细菌染色体DNA的提纯与纯化
细菌染色体DNA的提纯、纯化与电泳检测摘要本实验用试剂盒 Bacterial DNA isolation kit(Omega) 提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA, 并且通过一系列的分离纯化技术将其染色体DNA与RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等杂质分开从而得到纯化的染色体DNA分子。
通过琼脂糖凝胶电泳的方法可以分析所提取染色DNA的量的多少，纯化结果如何，以及杂带产生的原因，从而在今后的实验中完善实验方法，严谨实验步骤。
关键词黄色粘球菌试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)琼脂糖凝胶电泳引言黄色粘球菌DK1622是一种特殊的细菌，它不含质粒DNA，只含染色体DNA，所以用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)提取的是他的染色体DNA。
此外，它还有其他特性：基因组全长9.13Mb，代时4小时，胞外基质富含粘多糖等。
生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。
真核细胞的DNA 主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。
而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合，因此，黄色粘球菌DK1622的染色体DNA是裸露的，不与任何组蛋白结合。
染色体DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。
破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反复冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。
蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。
一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。
酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。
这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。
专业资料 DNA提取原理及步骤简述
DNA提取原理及步骤简述
DNA提取的步骤主要有裂解、结合、洗涤和洗脱。
以下是各步骤的作用原理：
1.裂解：这一步是必须的，因为DNA通常从细胞或其他生物
物质中被释放出来。
细胞裂解可以通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
其中，酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
2.结合：磁珠表面带负电荷，磁珠buffer是高盐环境有带
正电荷的盐离子，样本被buffer影响，磷酸基团带负电荷。
3.洗涤：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪
等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法
可将核酸分离、纯化。
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此
是理性的沉淀剂。
当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
4.洗脱：加水或者EB破坏高盐环境，形成低盐环境，使
DNA从磁珠上脱落。
请注意，以上步骤的作用原理可能因具体实验条件和设备而有所不同。
在进行实验时，请根据具体情况调整步骤和参数。
DNA提取的操作
DNA提取的操作基因组dna提取基因组dna提取试剂盒简介dna就是遗传信息的载体，就是最重要的生物信息分子，就是分子生物学研究的主要对象，为了展开测序、杂交、基因表达、文库构筑等试验，赢得低分子量和高纯度的基因组dna就是非常关键的前提，因此基因组dna的抽取也就是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作方式之一。
一、基因组dna抽取的原则1、保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。
2、确定其它分子(例如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，并使下游试验顺利进行。
二、基因组dna提取的原理和方法dna与组蛋白形成核小体，核小体织成成中空的螺旋管状结构，即为染色丝，染色丝再与许多非组蛋白构成染色体。
染色体存有于细胞核中，外存有核膜及胞膜。
从非政府中抽取dna必须先将非政府集中成单个细胞，然后碎裂胞膜及核膜，并使染色体转化成，同时除去与dna融合的组蛋白及非组蛋白。
1、样品预处理从各种不同来源的样品(如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等)中提取高纯度的基因组dna，因细胞结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了解，请参考本公司各基因组dna提取试剂盒说明书。
部分样品预处理方式：植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶k处理细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞水解液回去红细胞2、细胞水解ctab法：适用于植物组织、真菌等。
ctab就是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸构成复合物。
该复合物在低盐溶液中(>0.7mnacl)就是氢氧化物的，通过有机溶剂裂解，除去蛋白、多糖、多酚等杂质后重新加入乙醇结晶即可并使核酸分离出来。
sds法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。
sds就是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，水解细胞，并使蛋白质变性、染色体解析。
细菌人工染色体文库的构建及应用
细菌人工染色体文库的构建及应用随着生物技术的迅速发展，细菌人工染色体文库作为一种新兴的技术平台，在基因组学、基因克隆、基因治疗等领域展现出巨大的潜力。
细菌人工染色体文库是一种利用细菌染色体作为载体，将外源基因克隆到细菌染色体上的技术。
与传统的基因组文库构建方法相比，细菌人工染色体文库具有更高的稳定性和可操作性，成为当前研究的热点。
细菌人工染色体文库构建的技术原理和基本流程细菌人工染色体文库构建的核心技术是将外源基因克隆到细菌染色体上。
需要提取细菌染色体作为载体；然后，将目的基因插入到载体上；将重组载体转化到受体细菌中。
与传统的基因组文库构建方法相比，细菌人工染色体文库构建具有更高的稳定性和可操作性。
传统的基因组文库构建需要依赖细胞分裂和基因重组，而细菌人工染色体文库则通过同源重组实现基因克隆，具有更高的精确性和可预测性。
以实际案例为例，详细阐述细菌人工染色体文库的构建步骤、实验流程及注意事项在实际操作中，构建细菌人工染色体文库需要以下步骤： (1)提取细菌染色体：从受体细菌中提取完整的染色体作为载体； (2)目的基因的获得：从供体细胞中提取目的基因； (3)载体与目的基因的连接：将目的基因插入到细菌染色体载体上； (4)转化受体细菌：将重组载体转化到受体细菌中； (5)筛选与鉴定：对转化后的受体细菌进行筛选和鉴定，确保正确克隆。
实验流程中需要注意以下几点： (1)实验操作过程中保持无菌环境，避免污染； (2)目的基因的插入位点应选择合适，避免对载体的稳定性和功能造成影响； (3)转化受体细菌时，应选择合适的培养条件，提高转化效率； (4)筛选和鉴定过程中，要设定准确的阳性对照，保证实验结果的可靠性。
介绍细菌人工染色体文库的应用领域，并分析其与传统基因组文库应用领域的优劣对比细菌人工染色体文库在多个领域都有广泛的应用，如基因组学研究、基因克隆、基因治疗等。
在基因组学研究方面，细菌人工染色体文库可以用于研究基因组结构、基因组进化、基因组编辑等方面，具有更高的稳定性和可操作性。
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
35
6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
31
方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
细菌质粒提取原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
细菌培养及菌体收集
基因工程实验流程参考图：细菌培养及菌体收集挑取单菌落于5 ml 2216E培养基中，8℃培养，100 rpm转速，振荡120 h后，12 000 rpm 离心15 min。
弃去上清液，加入10 ml TE洗涤离心后，用10 ml TE溶解菌体，混匀，–20℃保存备用。
实验一：菌株基因组DNA的提取（CTAB 方法）CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml 水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；原理：采用溶菌酶破碎细菌细胞壁，加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞，可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
最后得到DNA。
操作流程：取3.5 ml菌悬液，加入184 μl 10% SDS，混匀，溶菌酶浓度为2mg/ml，37℃温育1 h。
加入740 μl 5 M NaCl，再加入512 μl CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10 min。
加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
上清液中加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
加入0.6倍异丙醇，混匀，10 000 rpm离心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
用1 ml TE溶解DNA，加入终浓度为20 μg/ml RNaseA，4℃溶解过夜，–20 ℃保存。
实验二：DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。
不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌基因组DNA的提纯与纯化姓名学号同组人班级实验时间摘要：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。
目前，有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。
本次实验选用黄色粘球菌DK1622，使用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)进行细菌基因组DNA的提纯与纯化，旨在学习并掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法。
通过本次实验，我们达到了实验预期，取得了良好的实验效果。
关键词：黄色粘球菌DK1622、基因组DNA、试剂盒法1.引言生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。
真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。
而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合。
基因组DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。
破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反夏冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。
蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。
一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。
酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。
这种方法对于去除DNA 中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。
少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中也会有RNA杂质，但RNA极易降解。
况且，少量的RNA对DNA操作无大影响，必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。
为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心将核酸回收。
用70%～80%乙醇洗涤沉淀，可除去沉淀中多余的盐，以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。
在进行基因组的大量提取时，利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器的小分子DNA或质粒DNA分离。
由于基因组DNA一般都很长，对剪切力十分敏感，提取时容易发生机械断裂，产生大小不同的片段。
因此，在基因组DNA提取过程中，为保证得到较长的DNA，应尽量避免以下因素导致的DNA降解：（1）物理降解。
在实际操作时应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。
此外，操作所用的吸头口不能太小，应剪去尖端部分，使其孔径变大。
（2）细胞内源DNase的作用。
细胞内常存在活性很高的DNase，细胞破碎后，DNase 便可与DNA接触并使之降解。
为了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。
EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。
SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。
（3）化学因素也会降解DNA。
例如，过酸的条件下，由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂。
因此，在DNA提取过程中，应避免采用过酸条件。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。
目前，也有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。
各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。
因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。
此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。
在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。
核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。
（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。
在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA （Liner DNA）分子。
这三种构型的分子有不同的迁移率。
一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。
（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。
通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。
（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。
电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。
（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。
常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。
电泳缓冲液的作用：①维持合适的pH。
电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-→2H2O+O2），负极发生还原反应（4H++4e-→2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。
一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；②使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01～0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1～2mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。
（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。
不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5％时凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。
2.材料和方法2.1材料和试剂实验菌株：黄色粘球菌DK1622实验试剂：试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)、TE溶液、BTL buffer、proteinase K 溶液、RNase A、BDL buffer、无水乙醇、buffer HB、wash buffer、Elution Buffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddH2O、1×TAE缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6/10×loading buffer）实验仪器：离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mL Ep 管2.2方法2.2.1试剂盒法提取细菌基因组DNA（1）将黄色粘球菌培养液倒入1.5mL Ep管中，在离心机中10,000rpm离心2min，弃上清。
（2）重复收集一次，即继续向刚才的1.5mL Ep管中倒入黄色粘球菌培养液，重复以上步骤，使1.5mL Ep管中共收集3.0mL培养液中的菌体。
（3）向菌体沉淀中加入500μL TE，充分涡旋重悬。
（4）将菌液在离心机中10,000rpm离心2min，尽可能吸弃上清。
（5）向菌体沉淀中加入200μL BTL buffer，涡旋重悬。
（6）向菌液中加入25μL proteinase K溶液，涡旋混匀；（7）将菌液55℃水浴45min，期间每15～20min振荡混匀一次。
（8）向菌液中加入5μL RNase A，颠倒混匀。
（9）将菌液放置在水浴锅中37℃水浴30min。
（10）将菌液在离心机中12,000rpm离心5min。
（11）小心转移上清到一新的Ep管中。
（12）加入220μL BDL buffer，颠倒混匀。
（13）65℃水浴10min。
（14）加入220μL 无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀。
（15）将DNA纯化柱（蓝色）组装到2mL收集管上。
（16）将上述样品全部、小心转移到柱子中。
（17）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（18）将柱子组装到第二个收集管上，加入500μL buffer HB。
（19）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（20）将柱子组装到同一个收集管上，加入700μL wash buffer。
（21）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（22）重复洗涤一次，即再加入700μL wash buffer，12,000rpm离心1min，弃流出液。
（23）使用同一收集管，13,000rpm离心2min。
（24）将柱子安装到新的Ep管上，加入50μL 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min。
（25）12,000rpm离心1min，收集DNA。
（26）重复收集一次。
2.2.2琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA（1）0.8%琼脂糖凝胶的制备。
①正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。
②取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.3g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒。
③待溶液冷却至60℃左右，加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5μg/mL，混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。
之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE电泳缓冲液），即可上样。