实验四甘油三酯测定(范玉平)

实验方法选择原则
①实用性：速度快、标本用量少、操作简便、 安全可行。 ②可信性：精密度、准确度、敏感性、特异性 均达到要求。
实验四 血清三酰甘油测定
实验目的: 实验目的
1.掌握酶法测定血清中三酰甘油的原理 1.掌握酶法测定血清中三酰甘油的原理 掌握酶法测定血清中三酰甘油 和意义． 和意义． 2.了解三酰甘油的正常值范围. 2.了解三酰甘油的正常值范围 了解三酰甘油的正常值范围.
酶法
1.磷酸甘油氧化酶法 1.磷酸甘油氧化酶法 最为普遍使用 酶试剂稳定，灵敏度高，线性范围宽 2.乳酸脱氢酶法 结果准确，但灵敏度低， 2.乳酸脱氢酶法 试剂不太稳定 3.甘油氧化酶法 3.甘油氧化酶法
磷酸甘油氧化酶法实验原理 实验原理: 实验原理
LPL
TG + H2O 甘油+FFA 甘油
GK
甘油+ 甘油+ATP
磷酸+ADP 甘油-3-磷酸 磷酸
磷酸二羟丙酮+H 磷酸二羟丙酮 2O2
GPO
甘油-3-磷酸 甘油 磷酸+O2 磷酸
H2O2+4-AAP+DHBS
POD
醌亚胺+ 醌亚胺 H2O
实验操作(手工分析） 实验操作 手工分析）: 手工分析
加入物 蒸馏水（ul） 蒸馏水（ul） 标准液 （ul） ul） 样本 （ul） ul） 酶工作液（ml) 酶工作液（ml) 空白管 标准管 样本管 20 —— —— —— 20 —— —— —— 20 1.5 1.5 1.5
①决定性方法（definitive method）是指准确度最 method） 决定性方法（ 高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发 系统误差最小，经过详细的研究， 现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方 法，测定结果为“确定值”，与“真值”最接 测定结果为“确定值” 真值” 近。由于技术要求太高，费用昂贵， 由于技术要求太高，费用昂贵， 用途：一级标准品定值； 用途：一级标准品定值；参考方法评价 ( 一般不用 于常规工作 )
混匀，37℃孵育15min，以空白管调零，520nm波 混匀，37℃孵育15min，以空白管调零，520nm波 长处测定各管吸光度值(A)。 长处测定各管吸光度值(A)。
酶工作液
试剂1 试剂1（稀释液） 过氧化物酶 EDTA 4-氨基安替比林 4缓冲剂 试剂2 试剂2（酶试剂） 脂蛋白脂酶 ATP EDTA 甘油激酶 甘油磷酸氧化酶 3，5-二氯-2-羟基苯 二氯磺酸盐 Mg2+
TG的生物化学
一 ， 血清甘油三酯/三酰甘油（TG），是 一项重要的临床血脂常规测定指标，特别 是随着对其致动脉粥样硬化（AS）作用研 究的深入，TG作为冠心病的一项独立的危 险因素日益受到重视 。
TG的生物化学
二 TG又称中性脂肪，由3分子脂肪酸和 TG又称中性脂肪，由3 1分子甘油酯化而成，是体内能量的主 要来源。TG处于脂蛋白的核心，在血 要来源。TG处于脂蛋白的核心，在血 中以脂蛋白形式运输。
除TG外，外周血中还存在甘油二酯、甘油一 TG外，外周血中还存在甘油二酯、甘油一 酯（两者总和不足TG的3%）和游离甘油 酯（两者总和不足TG的3%）和游离甘油 （FG）。各种脂蛋白中，乳糜微粒（CM）、 FG）。各种脂蛋白中，乳糜微粒（CM）、 极低密度脂蛋白（VLDL）及其残粒中，TG 极低密度脂蛋白（VLDL）及其残粒中，TG 含量高，被统称为富含TG脂蛋白（TRL）， 含量高，被统称为富含TG脂蛋白（TRL）， 也称残粒样脂蛋白（RLP） 也称残粒样脂蛋白（RLP）
化学法
1.Van Handel-Caslson法（二氯甲烷-硅酸Handel-Caslson法（二氯甲烷-硅酸变色酸法） 比较准确 2.分溶抽提-乙酰丙酮显色法 比较简便， 2.分溶抽提条件温和，但灵敏度低 基本步骤：抽提、皂化、氧化、显色 基本步骤：抽提、皂化、氧化、显色
色谱法
核素稀释/气相色谱/质谱技术（ID/GC/MS） 核素稀释/气相色谱/质谱技术（ID/GC/MS） 主要用作参考系统中决定性方法的建立及 参考物质的制备与定值，此法费用昂贵， 参考物质的制备与定值，此法费用昂贵， 样品处理复杂，难以推广应用。 样品处理复杂，难以推广应用。
计算TG的含量 计算 的含量
甘油三酯浓度（mmol/L)=A样/A标×标准液浓度 甘油三酯浓度
(2.26mmol/L)
单位换算：
甘油三酯mmol/L×88.5=甘油三酯 甘油三酯 甘油三酯mg/dL 甘油三酯
实验操作(自动分析） 实验操作 自动分析） 自动分析
空白管 校准管 质控管 样本管 试剂1 ul） 试剂1 （ul） 240 240 240 240 蒸馏水（ul） 蒸馏水（ul） 3 —— —— —— 标准液 （ul） —— ul） 3 —— —— 质控液 （ul） —— ul） —— 3 —— 样本（ul） 样本（ul） —— —— —— 3 混匀，37℃孵育5min 混匀，37℃孵育5min 试剂2 ul） 试剂2（ul） 60 60 60 60 混匀，37℃孵育5min，以空白管调零，520nm波长处测定各管 混匀，37℃孵育5min，以空白管调零，520nm波长处测定各管 吸光度值(A)。 吸光度值(A)。
TG的代谢
外源性途径 内源性途径
外源性途径： 外源性途径：
指食物中的TG在小肠内水解成脂肪酸和甘 指食物中的TG在小肠内水解成脂肪酸和甘 油一酯、二酯后由肠粘膜吸收入细胞， 油一酯、二酯后由肠粘膜吸收入细胞， 再合成TG并与其他脂质形成 再合成TG并与其他脂质形成CM，通过 并与其他脂质形成CM， 淋巴系统入血。CM中的 在脂蛋白脂 中的TG 淋巴系统入血。CM中的TG在脂蛋白脂 肪酶（LPL） 肪酶（LPL）作用下水解为甘油和游离 脂肪酸（FFA），被细胞利用或贮存。 ），被细胞利用或贮存 脂肪酸（FFA），被细胞利用或贮存。
正确度 大量测量的均值与真值的接
近程度。用偏倚表示不正确度 。 偏倚值( 偏倚值(Bias=Xi-x),
生化分析相关概念
精密度：表示测量结果中的随机误差大小
的程度，即指在一定条件下进行多次测 定时，所得结果之间的符合程度。 常用标准差或变异系数表示。
生化分析相关概念
实验方法分类
method） ①决定性方法（definitive method） 决定性方法（ ②参考方法（reference method） 参考方法（reference method） ③常规方法（routine method） 常规方法（routine method）
②参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经 参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经 充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差很小，与 重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏 度、特异性、直线性及较宽的分析范围。此类方法在条 件优越的实验室中应经常使用。但它主要应用于鉴定常 规方法，评价其误差大小，干扰因素，并决定其是否可 以被接受。 用途：它也用于二级标准品定值，也可用于评价商品试剂 盒等。 ( 有条件实验室可用于常规工作 )
误差和准确度属于不同概念，两者之 误差和准确度属于不同概念， 间不能划等号。 间不能划等号。
不准确度的数字表达是不确定度 (标准 标准 差和置信区间的半宽度表示)。 差和置信区间的半宽度表示 。 可以理解为测量结果与约定真值之差 可以理解为测量结果与约定真值之差 的范围。 的范围。
生化分析相关概念
内源性途径： 内源性途径：
CM水解产物—CM残粒以受体介导的 CM水解产物 CM残粒以受体介导的 水解产物— 形式被肝脏吸收，其衍生物和一些 形式被肝脏吸收， 新组分合成VLDL。 新组分合成VLDL。
TG测定的方法学
化学法 色谱法 酶法
化学法
化学法用有机溶剂氯仿抽提标本中的TG，去除抽 化学法用有机溶剂氯仿抽提标本中的TG，去除抽 提液中磷脂等干扰物后，用碱水解（皂化）TG， 提液中磷脂等干扰物后，用碱水解（皂化）TG， 以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应 以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应 测甲醛。但因操作步骤繁多、技术要求高、不 能自动化，而不适于常规工作应用。
临床意义
富含TG的脂蛋白是CHD的独立危险因 富含TG的脂蛋白是CHD的独立危险因 子，TG增加表明患者存在代谢综合症， 子，TG增加表明患者存在代谢综合症， 需进行治疗。 TG降低比较少见，甲状腺功能亢进、 TG降低比较少见，甲状腺功能亢进、 肾上腺皮质功能减退和肝功能严重损 伤时可见。
③常规方法（routine method）有足够的精密 常规方法（routine method）有足够的精密 度、准确性、特异性和适当分析范围。 用途：经方法评估和学术组织认可后推荐 为常规方法。 例如： TG 定量 决定性方法——同位素稀释/ 决定性方法——同位素稀释/质谱 ID/GC/MS） （ID/GC/MS） 参考方法——酶法 参考方法——酶法 常规方法——酶法 常规方法——酶法
注意要点： 注意要点：
1．酶试剂发红时，不可再用。 酶试剂发红时，不可再用。 2．加入显色剂要准确，加入后立即混匀。 加入显色剂要准确，加入后立即混匀。 3. 线性范围上限为11.4 mmol/L ，若超过用生理盐水 线性范围上限为11.4 稀释。 稀释。
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血清TG参考范围：
成人 0.45—1.69mmol/L(40—150mg/dL) 0.45—1.69mmol/L(40—
生化分析相关概念
准确度为一次测量结果与被测量的真值之间的 为一次测量结果与被测量的真值 真值之间的
一致程度。 一致程度。 准确度是一个定性的概念，用于定性描述，如 准确度是一个定性的概念，用于定性描述， 谈准确度高、 谈准确度高、低，是否合格。 是否合格。
测量误差:是测量结果减真值之差。 是测量结果减真值之差
临床意义
TG一般随年龄增加而升高，体重超过标准 TG一般随年龄增加而升高，体重超过标准 者往往偏高。 原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族 原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族 性高TG血症与家族性高脂（蛋白）血症 性高TG血症与家族性高脂（蛋白）血症 等。 继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、 继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、 甲状腺机能减退、肾病综合症、妊娠、 口服避孕药、酗酒等。