如何选择合适的细胞稳转株

如何选择合适的细胞稳转株

细胞稳转株是一种经过特定基因修饰的细胞株，可根据实验所需表达外源基因、进行基因敲除、敲入、以及精确改变基因序列（如点突变）。对比一般瞬转方法，利用细胞稳转株开展实验能够获得长期而稳定的特定性状，因此有助于增强实验的可重复性。细胞稳转株除了可用于基因调控研究，也非常适合于长周期的药物筛选和药理学研究、重组蛋白和抗体生产等实验。载体家凭借其资源完备的载体定制平台，通过病毒转导常规肿瘤细胞的方式可构建多种应用类型的细胞稳转株。

过表达模型细胞稳转株

通过慢病毒系统或转座子系统将外源基因表达框稳定整合进靶细胞基因组，实现外源基因在靶细胞的长期稳定表达。对比瞬转方法，构建过表达稳转株可避免瞬转中因转染效率导致的表达效率不一致的问题。构建好的细胞株中的外源基因不会因为细胞传代而丢失，可以持续表达特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重复实验时不需要对细胞重新转染质粒，大为节省了实验时间。

诱导表达模型细胞稳转株

采用Tet-on系统进行诱导表达目的基因，虽然可以直接进行质粒瞬转，但是载体家亦提供该类载体的慢病毒包装以构建相关的稳转细胞株。构建好的Tet-On系统细胞株同时表达tTS和rtTA 两种转录调控因子,而目的基因的表达可受四环素调控。其中tTS在四环素不存在的情况下会结合目的基因的上游TRE启动子，抑制目的基因表达。在细胞体系中添加四环素或其类似物后，rtTA进行响应并结合TRE启动子，激活目的基因表达。

shRNA干扰模型细胞稳转株

shRNA稳转株一般使用慢病毒或逆转录病毒在靶细胞基因组中导入shRNA表达框，实现shRNA在细胞系中的长期稳定表达。不同于siRNA瞬转，shRNA稳转株可内源性地稳定表达siRNA效果，不受转染效率影响，从而获得更稳定的基因敲低效果

CRISPR基因编辑细胞稳转株

构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。载体家提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。

CRISPR基因编辑系统可选择单gRNA或双gRNA表达方式。双gRNA表达载体常用于以下需要两个gRNA同时打靶的场景：1）双gRNA引导两个Cas9 nickase分别打靶靶位点的正反义DNA链，形成DSB并获得比单gRNA更特异的打靶效果；2）通过在形成两个DSB，实现目标序列的大片段删除；3）同时打靶两个不同的基因。双gRNA表达载体由两个U6启动子驱动gRNA的表达。

载体家CRISPR基因编辑载体可采用多类方式进行转导靶细胞。除基因敲入和定点突变常用的gRNA瞬转Cas9稳转株的方法外，我们还提供慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、PiggyBac转座子载体等多种外源基因转导方式，以满足体外或体内多样CRISPR基因编辑实验需求。

CRISPR基因调控细胞稳转株

该种细胞株采用的CRISPRa和CRISPRi技术是新兴的两种基因表达调控工具。CRISPRa采用的dCas9-SAM基因激活系统由个三个组分构成，每个组分分别由单独的慢病毒载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。表达这三种组分的细胞株中，用户定制的gRNA募集MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64到gRNA靶位点，从而组装出SAM 转录激活复合体。SAM复合体一般结合于靶基因上游启动子区域，通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同相互作用实现下游靶基因的转录激活。该种细胞株可以用于基因组的大规模筛选，如文库构建过程，也可用于研究单个或一系列基因的表达功能。

CRISPRi采用dCas-KRAB系统，可实现比RNAi更高效的基因沉默效果，但是对比采用CRISPR 敲除构建的功能缺失模型，又有不改变靶基因序列的优点。dCas9-KRAB CRISPRi细胞株使用慢病毒转导gRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。细胞株表达的dCas9-KRAB转录抑制复合物结合于靶基因上游区域，阻碍RNA pol进行下游转录，可从源头上抑制基因功能性表达。

冠状病毒试验用细胞株

载体家提供的CoronaAssay™冠状病毒试验用细胞株是我们专门为研究冠状病毒入侵细胞机制开发的定制产品，由Hela细胞和293T细胞改造获得。该细胞株可稳定表达一系列已知的野生型或突变型冠状病毒S蛋白受体，如人源ACE2、DDP4和ANPEP，以及小鼠Cwacam1。CoronaAssay™细胞株也可以表达人源TMPRSS2，一种跨膜丝氨酸蛋白酶，对利用ACE2、DPP4、ANPEP或其他唾液酸受体的冠状病毒感染过程有协同作用。对比寻找表达S蛋白受体的天然细胞，人工表达S蛋白的细胞株显然具有更强的灵活性以及可实现更高的S蛋白受体表达水平。

载体家的细胞技术团队拥有资深经验，除了以上类型的稳转株构建，还可以进行量身定做的个性化基因修饰的细胞株。根据实验目的、修饰位点和细胞株类型选择最佳的外源基因导入

方式。标准药筛过后，多克隆细胞群或者单克隆细胞系经传代、验证后才进行交付。所有使用细胞株均保证携带理想的基因型，无污染且经ATCC标准认证。

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