分子克隆以及蛋白纯化流程
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3.收集菌液至50ml离心管，3200rpm，离心30min、
4.取30,ul新鲜beads到1.5ul的EP管，用水洗3次，3000rpm，2min，再用裂解buffer洗一次
5.吸尽上清，用3ml裂解buffer 重悬，取1.5ml至EP管，超声破碎，“3s 6s 75w”’，3min待液体至澄清
10.在吸附柱中间部位加入50ul洗脱液EB（洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应小于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
2.加入3个凝胶体积的bufferDE-A，混匀后75°加热，间断混匀2-3min，直至凝胶完全溶解
3.加入0.5个体积bufferDE_A的buffer-B，混匀，当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入一个凝胶体积的异丙醇
4.吸取步骤3中的混合液，转移至DNA制备管中，，12000g离心1min，弃滤液。
RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
DTT(0.1M) 1ul
RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1ul
Superscript IIIRT 1ul
4.PCR 25°C，10min；42°C，50min；70°C，5min；4°C10min
PCR
1. DNA模板 2ul
正向引物 2ul
反向引物 2ul
2×TaqPCRstarmix20ul
ddH20 14ul
条件
94°C 5min
94°C 30S
55-65°C 30S
72°C30-60s/kb
72°C5min
25-30个cycles
切胶回收
1.紫外灯下切含有目的片段的条带，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，计算凝胶的重量，该重量作为一个凝胶体积，100mg=100ul
收集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集足够的菌体。
2.用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
3.加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转4-7次是菌体充分裂解， 室温放置4分钟。
4.加350ul溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色素状沉淀，13000rpm离心10分钟，小心取上清。
5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
可选步骤：加入500ul去蛋白液PE，13000rpm离心30-60s，弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可忽略过此步骤。
5.4000rpm，ห้องสมุดไป่ตู้0min，4°C弃上清
6.50ml沉淀用10ml0.1MCacl2重悬，冰上放30min，收为一管
7.4000rpm，10min，4°C弃上清
8.总5ml(0.1MCacl2+15%甘油)/150ml 菌液重悬
9.分装500ul/管，液氮速冻后放-80°C保存
注意事项
①低温，全程在冰盒上操作上完成
5.将制备管置回2ml离心管中，加入500ulbufferW1，12000g，离心30S，弃滤液。
6.将制备管置回2ml离心管中，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
以同样的方法，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
7.将制备管放回2ml制备管中，12000g离心1min
6.加入500ul漂洗液WB(检查是否加入了无水乙醇)，12000rpm，离心30s，弃掉废液。
7.加入500ul漂洗液WB，12000rpm，离心30S，弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm，离心两分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残存乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，室温放置10分钟。
4.3000rpm 低速离心 1min， 弃上清用150ulLB培养基重悬菌体
5.用涂布棒涂到相应的含抗生素的LB固体培养基平板上，37°C过夜培养12-16h
6.取出平板，挑取单克隆到含5-10mlLB培养基的50ml锥形瓶中，37°C恒温培养12-16h
质粒提取
此步骤是根据Biomed试剂盒
注意事项：
1.第一次使用前在漂洗液WB和去蛋白液中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标志加入乙醇，以免多次加入！
2.将RNaseA全部加入溶液1中，混匀，每次使用后置于2-8°C保存。
3.将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量
操作步骤
1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30s，尽可能倒干上清，收集菌体。
RNA提取
①取TRIZOL冻存裂解的细胞，室温放5分钟使其完全溶解。
②两相分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
8.将制备管置于洁净的1.5ml的离心管中，在制备管膜中央加入50ul去离子水，室温静置1min，12000g，离心1min。
酶切
双酶切50ul体系
回收的目的基因（载体）41ul
5Xbuffer5ul
酶1 2ul
酶2 2ul
37°过夜后，凝胶电泳和切胶回收
连接
10ul体系
载体 2ul
目的基因 6ul
②动作轻柔，用枪头轻轻搅拌混匀，不要用枪头吹打或涡旋器振荡
③检测是否制备成功的方法：用抗性质粒转化感受态，看是否能在相应的抗性平板上长出单菌落
④使用超净工作台进行无菌操作
试表达
1.挑取BL21平板上单菌落于含抗生素抗性的100mlLB培养基中，37°过夜培养12小时
2.菌液摇到一定浓度后，调节温度让菌体到16°C，加入终浓度为200-300mM的IPTG诱导16-20小时
逆转录
1.First-strandcDNAsynthesis
体系 oligo(DT) 50uM1ul
10pg-500ngmRNA10ul
Randomprimer1ul
dNTPmix(10mM) 1ul
2.65°C，5min后冰上孵育至少1min
3.稍微离心后，加入
5Xfirst-strandbuffer4ul
6. 4°C，18000rpm，离心30min，取上清样和beads样
7.将上清结合到beads上，充分混匀后，4°C搅拌60min
8.吸尽上清，用裂解buffer洗3次，取beads样
9.SDS-蛋白电泳
大量表达
1.挑取BL21上的单克隆于100ml LB培养基中，37°过夜培养12h
2.过夜后菌液到一定浓度，100ml菌液分到3个800ml的LB培养基中，培养至一定浓度后用终浓度为200-300nM IPTG诱导16-20h
9.过离子交换柱后，取样浓缩到500ul以内
10.过分子筛，收集样品，浓缩至10mg/ml
3.菌液收集，3200rpm，离心30min
4.加入200-300ml裂解buffer 重悬菌体，用高压破碎仪破碎3次
5.18000rpm，4°，离心30min
6.取上清与处理好的beads结合，4°搅拌1h
7.3200rpm，4°，2min离心，弃上清，用裂解buffer重复3次
8.把结合蛋白的beads加入重力柱，用2-3个柱体积的buffer冲洗后，待其中裂解buffer流干后加入洗脱buffer，洗脱16ml至浓缩管，浓缩至5ml
④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
测序
感受态制备
试剂准备：0.1MCacl2过滤除菌；0.1MCacl2+15%丙三醇（高压灭菌）
1.平板划线(无抗生素)37°过夜培养
2.挑单菌落+5mlLB(无抗生素)，37°C，180rpm过夜培养
3.5ml过夜菌+150mlLB培养基，37C°180rpm，培养至OD到0.8-1.0
4.分装到50ml/管(超净工作台)，冰上放置15min
Buffer2ul
T4连接酶2ul
转化扩增
1.取出感受态菌，放冰上至呈液态，先取20ul感受态细胞加入1.5mlEP管，再取0.5-2ul加入连接产物或载体 2微升，轻轻旋转混匀，冰上静置孵育 30min
2.42 度热激 45s， 迅速冰上静置 2min
3.加入无抗 LB 培养基1ml， 37 度， 140rpm 孵育 1h
4.取30,ul新鲜beads到1.5ul的EP管，用水洗3次，3000rpm，2min，再用裂解buffer洗一次
5.吸尽上清，用3ml裂解buffer 重悬，取1.5ml至EP管，超声破碎，“3s 6s 75w”’，3min待液体至澄清
10.在吸附柱中间部位加入50ul洗脱液EB（洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应小于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
2.加入3个凝胶体积的bufferDE-A，混匀后75°加热，间断混匀2-3min，直至凝胶完全溶解
3.加入0.5个体积bufferDE_A的buffer-B，混匀，当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入一个凝胶体积的异丙醇
4.吸取步骤3中的混合液，转移至DNA制备管中，，12000g离心1min，弃滤液。
RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
DTT(0.1M) 1ul
RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1ul
Superscript IIIRT 1ul
4.PCR 25°C，10min；42°C，50min；70°C，5min；4°C10min
PCR
1. DNA模板 2ul
正向引物 2ul
反向引物 2ul
2×TaqPCRstarmix20ul
ddH20 14ul
条件
94°C 5min
94°C 30S
55-65°C 30S
72°C30-60s/kb
72°C5min
25-30个cycles
切胶回收
1.紫外灯下切含有目的片段的条带，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，计算凝胶的重量，该重量作为一个凝胶体积，100mg=100ul
收集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集足够的菌体。
2.用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
3.加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转4-7次是菌体充分裂解， 室温放置4分钟。
4.加350ul溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色素状沉淀，13000rpm离心10分钟，小心取上清。
5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
可选步骤：加入500ul去蛋白液PE，13000rpm离心30-60s，弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可忽略过此步骤。
5.4000rpm，ห้องสมุดไป่ตู้0min，4°C弃上清
6.50ml沉淀用10ml0.1MCacl2重悬，冰上放30min，收为一管
7.4000rpm，10min，4°C弃上清
8.总5ml(0.1MCacl2+15%甘油)/150ml 菌液重悬
9.分装500ul/管，液氮速冻后放-80°C保存
注意事项
①低温，全程在冰盒上操作上完成
5.将制备管置回2ml离心管中，加入500ulbufferW1，12000g，离心30S，弃滤液。
6.将制备管置回2ml离心管中，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
以同样的方法，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
7.将制备管放回2ml制备管中，12000g离心1min
6.加入500ul漂洗液WB(检查是否加入了无水乙醇)，12000rpm，离心30s，弃掉废液。
7.加入500ul漂洗液WB，12000rpm，离心30S，弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm，离心两分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残存乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，室温放置10分钟。
4.3000rpm 低速离心 1min， 弃上清用150ulLB培养基重悬菌体
5.用涂布棒涂到相应的含抗生素的LB固体培养基平板上，37°C过夜培养12-16h
6.取出平板，挑取单克隆到含5-10mlLB培养基的50ml锥形瓶中，37°C恒温培养12-16h
质粒提取
此步骤是根据Biomed试剂盒
注意事项：
1.第一次使用前在漂洗液WB和去蛋白液中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标志加入乙醇，以免多次加入！
2.将RNaseA全部加入溶液1中，混匀，每次使用后置于2-8°C保存。
3.将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量
操作步骤
1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30s，尽可能倒干上清，收集菌体。
RNA提取
①取TRIZOL冻存裂解的细胞，室温放5分钟使其完全溶解。
②两相分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
8.将制备管置于洁净的1.5ml的离心管中，在制备管膜中央加入50ul去离子水，室温静置1min，12000g，离心1min。
酶切
双酶切50ul体系
回收的目的基因（载体）41ul
5Xbuffer5ul
酶1 2ul
酶2 2ul
37°过夜后，凝胶电泳和切胶回收
连接
10ul体系
载体 2ul
目的基因 6ul
②动作轻柔，用枪头轻轻搅拌混匀，不要用枪头吹打或涡旋器振荡
③检测是否制备成功的方法：用抗性质粒转化感受态，看是否能在相应的抗性平板上长出单菌落
④使用超净工作台进行无菌操作
试表达
1.挑取BL21平板上单菌落于含抗生素抗性的100mlLB培养基中，37°过夜培养12小时
2.菌液摇到一定浓度后，调节温度让菌体到16°C，加入终浓度为200-300mM的IPTG诱导16-20小时
逆转录
1.First-strandcDNAsynthesis
体系 oligo(DT) 50uM1ul
10pg-500ngmRNA10ul
Randomprimer1ul
dNTPmix(10mM) 1ul
2.65°C，5min后冰上孵育至少1min
3.稍微离心后，加入
5Xfirst-strandbuffer4ul
6. 4°C，18000rpm，离心30min，取上清样和beads样
7.将上清结合到beads上，充分混匀后，4°C搅拌60min
8.吸尽上清，用裂解buffer洗3次，取beads样
9.SDS-蛋白电泳
大量表达
1.挑取BL21上的单克隆于100ml LB培养基中，37°过夜培养12h
2.过夜后菌液到一定浓度，100ml菌液分到3个800ml的LB培养基中，培养至一定浓度后用终浓度为200-300nM IPTG诱导16-20h
9.过离子交换柱后，取样浓缩到500ul以内
10.过分子筛，收集样品，浓缩至10mg/ml
3.菌液收集，3200rpm，离心30min
4.加入200-300ml裂解buffer 重悬菌体，用高压破碎仪破碎3次
5.18000rpm，4°，离心30min
6.取上清与处理好的beads结合，4°搅拌1h
7.3200rpm，4°，2min离心，弃上清，用裂解buffer重复3次
8.把结合蛋白的beads加入重力柱，用2-3个柱体积的buffer冲洗后，待其中裂解buffer流干后加入洗脱buffer，洗脱16ml至浓缩管，浓缩至5ml
④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
测序
感受态制备
试剂准备：0.1MCacl2过滤除菌；0.1MCacl2+15%丙三醇（高压灭菌）
1.平板划线(无抗生素)37°过夜培养
2.挑单菌落+5mlLB(无抗生素)，37°C，180rpm过夜培养
3.5ml过夜菌+150mlLB培养基，37C°180rpm，培养至OD到0.8-1.0
4.分装到50ml/管(超净工作台)，冰上放置15min
Buffer2ul
T4连接酶2ul
转化扩增
1.取出感受态菌，放冰上至呈液态，先取20ul感受态细胞加入1.5mlEP管，再取0.5-2ul加入连接产物或载体 2微升，轻轻旋转混匀，冰上静置孵育 30min
2.42 度热激 45s， 迅速冰上静置 2min
3.加入无抗 LB 培养基1ml， 37 度， 140rpm 孵育 1h