分子克隆以及蛋白纯化流程
蛋白表达纯化流程
蛋白表达纯化流程第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
蛋白纯化的步骤
蛋白纯化的步骤嘿，咱今儿就来说说蛋白纯化这档子事儿哈！你想想看，蛋白就像是一群调皮的小孩子，在那乱糟糟的环境里跑来跑去，咱得想办法把咱想要的那个小家伙给揪出来，让它干干净净、清清爽爽的，这就是蛋白纯化啦！首先呢，得准备好材料和工具，这就好比要出门得先找好鞋子和包包一样重要。
咱得有合适的缓冲液，就像是给蛋白们准备的舒适小窝。
然后呢，就是细胞破碎这一步啦！这就像是打破一个大罐子，把里面的东西都给放出来。
把细胞弄破，让蛋白们从里面跑出来。
接着呢，就是离心啦！这就好像是把一堆东西放到一个大转盘上，转啊转，重的就沉下去了，轻的就浮在上面啦。
通过离心，把那些杂质啊啥的都给分离开。
然后呢，就是过滤啦！这就像给蛋白们过筛子，把那些大块头的杂质都给筛掉，留下咱们要的那些细细小小的蛋白。
再接下来就是关键的层析啦！这可就像是走迷宫一样，不同的蛋白会在这个迷宫里走不同的路，咱就可以根据它们的特点把它们给分开啦。
这里面又有好多不同的方法呢，什么离子交换层析啦，凝胶过滤层析啦，亲和层析啦，每种都有自己独特的用处。
离子交换层析呢，就像是蛋白们根据自己带的电荷来选择走哪条路，带正电的走这边，带负电的走那边。
凝胶过滤层析呢，就像是根据蛋白的大小来决定它们走的快慢，大的走得慢，小的走得快。
亲和层析就更厉害啦，就好像是蛋白们看到了自己最喜欢的东西，一下子就粘上去啦，其他的就被淘汰掉啦。
哎呀呀，你说这蛋白纯化是不是很有意思啊！把那些乱七八糟的蛋白一点点地给弄清楚，给分离开，就像是在玩一个超级有趣的游戏一样。
等咱把蛋白纯化好了，那可就像是得到了宝贝一样开心呢！可以用来做各种实验啦，研究啦，为科学做出贡献啦！这可不是一件简单的事儿哦，但只要咱认真去做，肯定能成功的。
所以啊，蛋白纯化虽然步骤不少，但只要咱有耐心，有细心，有决心，就一定能把那些调皮的蛋白小家伙们给收拾得服服帖帖的！你说是不是呀！。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
【2017年整理】蛋白表达纯化实验步骤
【2017年整理】蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、 RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1) 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2) SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3) 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。
4) 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速(140-180rpm)，诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1) 取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。
2) 将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h)，然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录一、引言二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念2.分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建2.目的基因的获取与扩增3.基因片段的连接与重组4.转化与筛选5.克隆子的鉴定与分析四、分子克隆技术的应用1.在基因工程中的应用2.在蛋白质工程中的应用3.在生物制药中的应用五、分子克隆技术的发展趋势六、结论正文一、引言分子克隆技术是现代生物技术领域中的一项重要技术，它在基因工程、蛋白质工程、生物制药等领域具有广泛的应用。
本文将详细介绍分子克隆技术的概念与原理、操作步骤以及应用和发展趋势。
二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念分子克隆技术是指在体外将不同来源的基因片段通过基因工程技术进行拼接组装，形成一个新的基因表达载体，并将其导入受体细胞，使目的基因在受体细胞中表达的技术。
2.分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个方面：（1）载体的选择与构建：选择适合目的基因的载体，并将其构建为重组表达载体；（2）目的基因的获取与扩增：从原始基因中获取目的基因，并通过PCR 等方法进行扩增；（3）基因片段的连接与重组：将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体；（4）转化与筛选：将重组基因表达载体导入受体细胞，并通过筛选得到表达目的基因的克隆子；（5）克隆子的鉴定与分析：对克隆子进行鉴定与分析，以确认其是否表达目的基因。
三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建选择适合目的基因的载体，如质粒、噬菌体等，并将其构建为重组表达载体，主要包括载体的切割、目的基因的插入、连接以及重组表达载体的转化等步骤。
2.目的基因的获取与扩增从原始基因中获取目的基因，可以通过基因合成、PCR 等方法进行扩增，获得足够量的目的基因。
3.基因片段的连接与重组将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体。
这一步通常采用 DNA 连接酶进行催化连接，同时需要使用适当的缓冲液和试剂。
分子克隆详细步骤
分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4℃)KCl 0.5MTris 0.1MNP-40 1%Tween-20 1%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：Total RNA 2ulOligo（dT18）primer 1ulDH water 9ul65℃ 5min 速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer 4ulRNAase inhibiter 1ul10m dNTP 2ulMMLV 1ul42℃ 60min70℃ 5min12℃ forever3、PCR体系20ul：10×buffer 2ul10m dNTP 0.5ulPrimer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu 0.2uldd water 15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme1 1ulEnzyme2 1ul10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）10×BSA 5ul （看需要）Template 1ugADD dd water to 50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录1.分子克隆技术的概念与原理2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用领域4.分子克隆技术的优势与局限性正文一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是一种在生物体外将特定 DNA 片段复制并插入到载体DNA 中的技术。
这种技术可以使得新的 DNA 分子与载体 DNA 相结合，形成一个具有自我复制能力的 DNA 分子。
在实际应用中，分子克隆技术主要通过将目的基因与载体 DNA 连接，从而实现对目的基因的扩增和表达。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：从待研究的生物体中提取需要克隆的 DNA 片段，通常使用 PCR 技术进行扩增。
2.构建载体：选择合适的载体 DNA，将其与目的基因连接，构建成一个完整的克隆载体。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体转化到受体细胞中，让受体细胞表达出目的基因。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从转化后的细胞中筛选出含有目的基因的克隆子。
5.鉴定克隆子：对筛选出的克隆子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、分子克隆技术的应用领域分子克隆技术在生物学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 连接，实现对目的基因的扩增和表达。
2.蛋白质工程：通过分子克隆技术，可以研究蛋白质的结构和功能，为药物研发提供重要依据。
3.基因组学：通过分子克隆技术，可以对基因组 DNA 进行拼接和分析，揭示生物体的基因组结构。
4.转基因技术：通过分子克隆技术，可以将目的基因插入到载体 DNA 中，实现对转基因生物的研究和开发。
四、分子克隆技术的优势与局限性分子克隆技术在生物学研究中具有明显的优势，如操作简单、扩增效率高、可控性强等。
然而，分子克隆技术也存在一定的局限性，如克隆效率受载体 DNA 大小限制、克隆过程中可能出现突变等。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。
3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。
4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。
加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。
可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录一、引言二、分子克隆技术的概念与原理1.分子克隆的定义2.分子克隆的基本原理三、分子克隆技术的应用1.大肠杆菌受体2.基因工程3.蛋白质工程四、分子克隆技术的操作步骤1.目的基因的获取2.载体的选择与构建3.转化与筛选4.克隆子的检测与鉴定五、分子克隆技术的优缺点1.优点2.缺点六、总结正文一、引言分子克隆技术作为一种生物技术手段，广泛应用于基因工程、蛋白质工程等领域。
通过对生物分子的切割、拼接和转化，实现对生物信息的复制和传递，从而为生物科学研究和应用提供有力支持。
本文将简要介绍分子克隆技术的概念与原理，重点阐述其在实际应用中的操作步骤和优缺点。
二、分子克隆技术的概念与原理1.分子克隆的定义分子克隆是指在体外将各种来源的生物分子（如基因、DNA 片段、蛋白质等）与适当的载体结合，形成一个新的分子体系，并通过转化等手段将其导入受体细胞，从而使目的分子在受体细胞中得以复制和表达。
2.分子克隆的基本原理分子克隆的基本原理主要包括以下几个方面：（1）分子切割：利用限制性内切酶（限制酶）对目的基因和载体进行切割，产生相同的黏性末端；（2）分子拼接：通过 DNA 连接酶将切割后的目的基因和载体连接起来，形成重组子；（3）分子转化：将重组子导入受体细胞，使其在受体细胞中得以复制和表达；（4）分子筛选：通过筛选和鉴定，获得成功克隆的目的基因或蛋白质。
三、分子克隆技术的应用1.大肠杆菌受体大肠杆菌（Escherichia coli，简称 E.coli）作为分子克隆的常用受体细胞，具有生长快速、繁殖周期短、易于培养等优点。
在基因工程中，大肠杆菌常被用作基因克隆和表达的宿主细胞。
2.基因工程分子克隆技术在基因工程中的应用主要包括目的基因的克隆、基因的定点突变、基因的拼接等。
通过分子克隆技术，可以实现对基因的精确操作，为生物学研究和基因治疗等提供基础。
3.蛋白质工程分子克隆技术在蛋白质工程中的应用主要包括蛋白质的表达和纯化。
分子克隆以及蛋白纯化流程
分子克隆以及蛋白纯化流程分子克隆是利用重组DNA技术将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
它是现代生物技术中最常用的技术之一，被广泛用于基因工程、基因治疗、药物研发等领域。
蛋白纯化则是从复杂的混合物中分离和纯化目标蛋白质的过程，用于蛋白质的进一步研究和应用。
分子克隆的步骤通常包括：1.获取目标基因：从目标生物体中提取DNA，或通过合成DNA片段获得目标基因。
2.DNA片段的处理：将目标基因与载体DNA进行酶切，利用酶切酶切割酶将片段粘贴到载体DNA上。
3.载体构建：将连接好的基因载体转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌等。
4.选择与鉴定：利用抗生素等筛选方法，筛选带有目标基因的转化细胞，并通过PCR、酶切等方法验证克隆是否成功。
5.大规模培养：将带有目标基因的细胞进行大规模培养，以获取足够数量的重组蛋白质。
蛋白纯化的一般流程如下：1.细胞裂解：使用各种方法如超声波、高压等将菌体或细胞破裂，释放目标蛋白质。
2.清除杂质：通过离心等方法去除琼脂、酶、核酸等杂质。
3.选择性分离：利用特异性亲和剂、柱层析、电泳等方法将目标蛋白质分离出来。
4.蛋白质的浓缩和纯化：通过滤膜、浓缩柱、洗脱缓冲等方法将目标蛋白质浓缩并进一步纯化。
5.成品蛋白质的储存和保存：将纯化得到的目标蛋白质进行储存，以备后续研究和应用。
需要注意的是，以上仅为分子克隆和蛋白纯化的一般流程，具体的步骤可能会因实验设计、目标蛋白质的性质和要求等而有所不同。
此外，实验过程中还需要配制相应的缓冲液、培养基和试剂，操作注意安全和操作规范。
分子克隆和蛋白纯化是复杂而精细的实验技术，需要仔细操作和合理设计实验方案，以确保实验的成功和结果的准确性。
分子克隆与表达实验
分子克隆与表达实验流程1.选取菌株从保存的海冰细菌中随机选取某几株，挑取其单菌落于发酵培养基（2216）活化培养，1d后将活化的菌株5ml接入70ml发酵培养基中，12℃，100rpm摇床培养，大约4~5d后对菌株在4℃下，12000rpm进行离心，收集菌体，于4℃保存。
2.提取菌株全基因组在超净工作台上取120μl离心后的菌株悬浮于400μl的1×TE缓冲液中，加入10%SDS 100μl和2mg/mL的溶菌酶20μl，混匀后置于37℃保温1h，加入5M 的NaCl 70μl充分混匀，置于65℃水浴10min，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，离心（12000rpm、8min），取上层水相于新离心管中并加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）充分抽提，取上层水相加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70%的乙醇淋洗两次，倾去乙醇，真空干燥后溶于25μl的1×TE缓冲液。
对全基因组进行电泳检验，其余的置-4℃冰箱保存备用。
3.根据目的蛋白设计引物本实验研究的是小分子蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）、硫氧还蛋白（Trx）和谷氧还蛋白（Grx）。
根据这三种蛋白的基因用Primer5设计引物。
引物名称与序列引物名称引物序列，方向5′——3′合成规格(OD)GST1(1) TTTATGGYGTMCCKCTTTCTC 2GST1(2) CA TGCTSCA TATTSATTAWCTG 2GST2(1) AGTSTCGCCGTTTAATCAACC 2GST2(2) YKCATY AAKYTGCTCRCCMSC 2GST3(1) TTTA TGGCGTACCTCTTTCTCC 2GST3(2) CGGTAA TACCTAACTGCTCAGC 2GST4(1) TCTGTTACCTCGCCTTAT 2GST4(2) AAAGCCA TTATCTTCTGC 2GST5(1) ACTTA TTTGGAGCA TTGAGCGG 2GST5(2) TCGGCGGTTCAAGAAAAG 2Trx1(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATCC 2Trx1(2) CGCAAGCTTTTAAAGA TTGTTTTCTA 2Trx2(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATC 2Trx2(2) CTCAAGCTTTTAGA TGTTGTTTTCTA 2Trx3(1) CGGAGAGCCA TA TGAGCGAGAA 2Trx3(2) TTGTTTAAATCTCGAGATTGTTTTCT 2Grx1(1) GTGTTATCTGGTGGTA TGG 2Grx1(2) TTGTGCTGCTGCGTTTTG 24.PCR扩增以菌株的全基因组为模板，对上述引物进行PCR，从中寻找含有目的基因的菌株，对含有目的基因的菌株进行验证并保种。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
分子克隆全过程
分子克隆全过程本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序1) 基因组DNA提取（以家蚕为例）1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA 抽提缓冲液，在冰上充分研磨，转入5ml的离心管；2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h；3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h；4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管；5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清；6. 重复5，再抽提1次；7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的无水乙醇，充分混匀，4℃过夜9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。
用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干；10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA；11. 检测OD值；12. 做好标记，以供进一步实验之用。
2) 感受态细胞的制备1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时；2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5 h，使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成）4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L 冷CaCl2中，冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！）5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清；6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。
分子克隆——主要步骤
.笔录 3（分子克隆 2——主要步骤）分子克隆能够分为以下几个步骤：（1）带有目的基因的 DNA 片段的获取（2）重组 DNA 分子的建立（3）重组 DNA 分子的转变和重组克隆的挑选（4）特定重组克隆的鉴识分别制备待克隆的DNA 片段————将靶 DNA 片段与载体在体外进行连接————重组 DNA 分子转入宿主细胞————挑选、判定阳性重组子————重组子的扩增。
1.带有目的基因的 DNA片段的获取：能够用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其余实验手段获取待定的DNA片段，能够用超速离心的方法分别出拥有特定核苷酸构成的DNA片段，能够用 mRNA做模板，用反转录酶合成互补 DNA，即 cDNA，也能够用化学合成的方法直接合成一段 DNA。
2.重组 DNA分子的建立：重组 DNA分子中包含两部分，一部分是外源 DNA，即目的 DNA片段，另一部分是载体 DNA。
用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒 DNA。
它们的基本特点是能够独立复制。
假如用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的尾端完整相同，因为有互补的单链尾端序列存在，在连结酶的作用下，就能够形成重组DNA 分子。
在没有互补单链尾端的状况下，也能够用酶学方法造成一个互补单链尾端以后再进行连结。
.3.重组 DNA分子的转变和重组克隆的挑选：重组 DNA分子一定进入宿主细胞中，才能获取扩增和表达．这个过程叫做转化。
大肠杆菌是当前使用最宽泛的宿主细胞。
除此之外．其余细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，能够依据实验的需要加以选择。
在被转变的宿主细胞中，不一样的单个细胞 ( 在平板上表现为单个菌落，亦称克隆 ) 中可能含有不一样的重组质粒或非重组质粒，所以一定进行挑选，以便确立哪些是重组克隆。
挑选能够使用抗菌素抗性或其余方法，依载体的性质而定。
4.特定重组克隆的鉴识：因为重组克隆常常是许多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴识。
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7.将上清结合到beads上，充分混匀后，4°C搅拌60min
8.吸尽上清，用裂解buffer洗3次，取beads样
9.SDS-蛋白电泳
大量表达
1.挑取BL21上的单克隆于100ml LB培养基中，37°过夜培养12h
2.过夜后菌液到一定浓度，100ml菌液分到3个800ml的LB培养基中，培养至一定浓度后用终浓度为200-300nM IPTG诱导16-20h
1.第一次使用前在漂洗液WB和去蛋白液中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标志加入乙醇，以免多次加入！
2.将RNaseA全部加入溶液1中，混匀，每次使用后置于2-8°C保存。
3.将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量
操作步骤
1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30s，尽可能倒干上清，收集菌体。
RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
可选步骤：加入500ul去蛋白液PE，13000rpm离心30-60s，弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可忽略过此步骤。
测序
感受态制备
试剂准备：0.1MCacl2过滤除菌；0.1MCacl2+15%丙三醇（高压灭菌）
1.平板划线(无抗生素)37°过夜培养
2.挑单菌落+5mlLB(无抗生素)，37°C，180rpm过夜培养
3.5ml过夜菌+150mlLB培养基，37C°180rpm，培养至OD到0.8-1.0
4.分装到50ml/管(超净工作台)，冰上放置15min
RNA提取
①取TRIZOL冻存裂解的细胞，室温放5分钟使其完全溶解。
②两相分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
收集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集足够的菌体。
2.用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
3.加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转4-7次是菌体充分裂解， 室温放置4分钟。
4.加350ul溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色素状沉淀，13000rpm离心10分钟，小心取上清。
6.加入500ul漂洗液WB(检查是否加入了无水乙醇)，12000rpm，离心30s，弃掉废液。
7.加入500ul漂洗液WB，12000rpm，离心30S，弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm，离心两分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残存乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，室温放置10分钟。
10.在吸附柱中间部位加入50ul洗脱液EB（洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应小于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
8.将制备管置于洁净的1.5ml的离心管中，在制备管膜中央加入50ul去离子水，室温静置1min，12000g，离心1min。
酶切
双酶切50ul体系
回收的目的基因（载体）41ul
5Xbuffer5ul
酶1 2ul
酶2 2ul
37°过夜后，凝胶电泳和切胶回收
连接
10ul体系
载体 2ul
目的基因 6ul
Buffer2ul
T4连接酶2ul
转化扩增
1.取出感受态菌，放冰上至呈液态，先取20ul感受态细胞加入1.5mlEP管，再取0.5-2ul加入连接产物或载体 2微升，轻轻旋转混匀，冰上静置孵育 30min
2.42 度热激 45s， 迅速冰上静置 2min
3.加入无抗 LB 培养基1ml， 37 度， 140rpm 孵育 1h
2.加入3个凝胶体积的bufferDE-A，混匀后75°加热，间断混匀2-3min，直至凝胶完全溶解
3.加入0.5个体积bufferDE_A的buffer-B，混匀，当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入一个凝胶体积的异丙醇
4.吸取步骤3中的混合液，转移至DNA制备管中，，12000g离心1min，弃滤液。
DTT(0.1M) 1ul
RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1ul
Superscript IIIRT 1ul
4.PCR 25°C，10min；42°C，50min；70°C，5min；4°C10min
PCR
1. DNA模板 2ul
正向引物 2ul
反向引物 2ul
3.收集菌液至50ml离心管，3200rpm，离心30min、
4.取30,ul新鲜beads到1.5ul的EP管，用水洗3次，3000rpm，2min，再用裂解buffer洗一次
5.吸尽上清，用3ml裂解buffer 重悬，取1.5ml至EP管，超声破碎，“3s 6s 75w”’，3min待液体至澄清
②动作轻柔，用枪头轻轻搅拌混匀，不要用枪头吹打或涡旋器振荡
③检测是否制备成功的方法：用抗性质粒转化感受态，看是否能在相应的抗性平板上长出单菌落
④使用超净工作台进行无菌操作
试表达
1.挑取BL21平板上单菌落于含抗生素抗性的100mlLB培养基中，37°过夜培养12小时
2.菌液摇到一定浓度后，调节温度让菌体到16°C，加入终浓度为200-300mM的IPTG诱导16-20小时
④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2×TaqPCRstarmix20ul
ddH20 14ul
条件
94°C 5min
94°C 30S
55-65°C 30S
72°C30-60s/kb
72°C5min
25-30个cycles
切胶回收
1.紫外灯下切含有目的片段的条带，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，计算凝胶的重量，该重量作为一个凝胶体积，100mg=100ul
4.3000rpm 低速离心 1min， 弃上清用150ulLB培养基重悬菌体
5.用涂布棒涂到相应的含抗生素的பைடு நூலகம்B固体培养基平板上，37°C过夜培养12-16h
6.取出平板，挑取单克隆到含5-10mlLB培养基的50ml锥形瓶中，37°C恒温培养12-16h
质粒提取
此步骤是根据Biomed试剂盒
注意事项：
逆转录
1.First-strandcDNAsynthesis
体系 oligo(DT) 50uM1ul
10pg-500ngmRNA10ul
Randomprimer1ul
dNTPmix(10mM) 1ul
2.65°C，5min后冰上孵育至少1min
3.稍微离心后，加入
5Xfirst-strandbuffer4ul
5.将制备管置回2ml离心管中，加入500ulbufferW1，12000g，离心30S，弃滤液。
6.将制备管置回2ml离心管中，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
以同样的方法，加入700ulbufferW2，12000g，离心30S，弃滤液。
7.将制备管放回2ml制备管中，12000g离心1min
9.过离子交换柱后，取样浓缩到500ul以内
10.过分子筛，收集样品，浓缩至10mg/ml
3.菌液收集，3200rpm，离心30min
4.加入200-300ml裂解buffer 重悬菌体，用高压破碎仪破碎3次
5.18000rpm，4°，离心30min
6.取上清与处理好的beads结合，4°搅拌1h
7.3200rpm，4°，2min离心，弃上清，用裂解buffer重复3次
8.把结合蛋白的beads加入重力柱，用2-3个柱体积的buffer冲洗后，待其中裂解buffer流干后加入洗脱buffer，洗脱16ml至浓缩管，浓缩至5ml
5.4000rpm，10min，4°C弃上清
6.50ml沉淀用10ml0.1MCacl2重悬，冰上放30min，收为一管
7.4000rpm，10min，4°C弃上清
8.总5ml(0.1MCacl2+15%甘油)/150ml 菌液重悬
9.分装500ul/管，液氮速冻后放-80°C保存
注意事项
①低温，全程在冰盒上操作上完成