兽药人工抗原的合成方法

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人工抗原的合成及单克隆抗体的纯化

６３分析．
生理调理素 Ⅱ是中草药与氨基酸维生素的复合制剂，此制剂为粉末状。若与生物调理素Ｉ结合使用效果更好。此制剂价格低廉，使用方便，无毒副作用，无耐药性，且有防暑降温、抗
５３治疗试验．
受试鸡群为新乡市某鸡场的同一批４０周龄的新罗曼褐壳鸡３００只，０随初分为２组。发病鸡群出现明显的水样腹泻。且精神沉郁，采食量减少，产蛋下降时开始用药。用药方法是用一疗程（）停１，５ｄ，０ｄ再用一个疗程。试验组用生理调理素Ⅱ 拌料，添加量为１－％；％２对照组用蒽诺沙星饮水０１／ｇ同时．ｋ，ｇ用土霉素拌料８片／ｇ连用５ｄｌ，【。观察３。０ｄ
维普资讯
《黑龙江畜牧兽医）０５年第１２０期
动物保健品
反应可制备睾酮、醛睾酮等衍生物，应如下。反Ｏ回Ｈ流
－＋
６３
和很高的灵敏度，适合复杂物质的分析。酶免疫测定法（ＩＥＡ）
牛奶、血、肉及饲料中磺胺类药物的残留Ｈ。免疫分析几猪肌】
６结果与分析
６１预防试验结果（．见表１）
从表１验结果中可以得知，同等条件下，试在试验组比对照组死亡率低，护率高出６，均产蛋率高７，蛋重大，保％平％且
参考文献：
［］刘丽艳．１生物调理素对鸡流行性腹泻的防治研究［］黑龙江畜Ｊ．
剂与载体结合。
药物特有的杂环取代基【。许多情况下，６】半抗原不能直接和载体蛋白连接，可能因为这些半抗原无可供结合的功能基团，也可能是为了要得到专—性更高的抗体，必须保留这些基团不被取代，这时就需要合成这些半抗原的适当的衍生物，如甾体

二氯喹啉酸人工抗原的合成

－
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３０２－－ — —
江苏农业科学２０１３年第４ｌ卷第７期
魏松红，王娟，李兴海，等．二氨喹啉酸人工抗原的合成［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（７）：３０２ — ３０４
二氯喹啉酸人工抗原的合成
魏松红，王娟，李兴海，东琴，王振
ｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］．ＡｃｃＣｈｅｍＲｅｓ，２００８，４１（１）：６０ — ６８．
［３］ＮａｋａｓｈｉｍａＮ．Ｓｏｈｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓｗｉｔｈｃｏｎｄｅｎｓｅｄａｒｏｍａｔｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ
收稿日期：２０１２—１２— ２８
１．１．２仪器设备
旋转蒸发仪（Ｒ２１０，ＢＵＣＨＩ）、红外光谱分
析仪（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ６５，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、高效液相色谱一质谱联用仪（ＨＰＬＣ１１００／ＭＳＤＴｒａｐＳ护学院，辽宁沈阳１１０８６６）
摘要：以３，７一二氯一８一喹啉羧酸、草酰氯、５一氨基戊酸（Ｑ一５）为原料合成二氯喹啉酸半抗原，再采用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白［牛血清蛋白（ＢＳＡ）、鸡卵清蛋白（ＯＶＡ）］偶联合成相应的人工抗原。将半抗原用红外（ＩＲ）和核磁共振（Ｈ— ＮＭＲ）进行结构表征，通过紫外扫描证明二氯喹啉酸人工抗原（Ｑ一５一ＢＳＡ、Ｑ一５一ＯＶＡ）合成成功，

沙丁胺醇人工抗原的合成及抗体制备

中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2009, 30 (2) : 48～53
沙丁胺醇人工抗原的合成及抗体制备 3
孙海新 1 凌红丽 1 张玉兰 2 曹照真 2 高亚东 1 郗日沫 233
(1 青岛康地恩实业有限公司青岛 266111 2 山东大学化学与化工学院济南 250100)
图 5 SAL 包被抗原紫外扫描图 F ig. 5 UV absorbance of coa ting an tigen SAL
a: CL; b: OVA; c: CL2OVA
2. 2 抗体效价的测定
以 S /N ≥2 所对应的最大稀释倍数为阳性血清的抗体效价 ,检测结果表明 ,经五免以后沙丁胺醇抗血清效价达 32 000。 2. 3 抗体的特异性测定及标准曲线的建立间接 EL ISA 法的结果显示 ,沙丁胺醇抗体的最佳工作条件为 :包被抗原浓度 0. 625μg /m l,血清稀释倍数 1∶2000。以 SAL 作为竞争药物分子 ,用 CL 2cOVA 作为包被抗原进行竞争 EL ISA 检测所得抑制曲线如图 6 所示。由图 6 可见 , SAL 作为竞争药物 (浓度范围 0. 01ng /m l到 104 ng /m l)能与包被抗原竞争性地结合沙丁胺醇抗体 ,抑制了沙丁胺醇抗体与沙丁胺醇包被抗原的结合 ,其抑制百分比 (B /B0 % )与沙丁胺醇药物的浓度具有明显的线性关系 ,对于沙丁胺醇抗体的 IC50为 8. 79ng /m l。以沙丁胺醇浓度的 Lg值为横坐标 ,抑制百分比 (B /B0 % )为纵坐标制作沙丁胺醇抗体的标准曲线 ,如图 7所示。从图 7 可以看出 ,横坐标在 1 ～2 之间 ,即沙丁胺醇浓度在 1ng /m l～100ng /m l之间时 ,沙丁胺醇对抗体的竞争作用呈直线关系。表明本研究所合成的免疫原具有良好的免疫原性 ,能够刺激机体产生特异性抗体。

林可霉素人工抗原的合成与鉴定

林可霉素人工抗原的合成与鉴定张小辉;职爱民;侯玉泽;宋春美;王耀;龚芳;赵启法;张改平【摘要】拟合成并鉴定林可霉素( Lincomycin,LIN)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源LIN多克隆抗血清.采用高碘酸钠法将林可霉素与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫原LIN-BSA和包被原LIN-OVA,并采用紫外分光光度法(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果表明,半抗原LIN和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验(免疫BALB/c纯系小鼠)结果显示,3只小鼠效价均达1∶3 000,且2号小鼠多抗血清抗LIN的半数抑制质量浓度IC50为3.85 μg/L,与莫能菌素的交叉反应率为6.19％,与其他药物无交叉反应.表明成功获得高效价、特异性好、亲和力高的鼠源抗LIN多抗血清.%The goal of this study was to synthesize artificial antigen of lincomycin and to obtain its mice polyclonal antiserum. Artificial antigen LIN-BSA and LIN-OVA were synthesized using sodium perio-date by linking carrier proteins BSA and OVA to LIN. The antigen LIN-BSA and LIN-OVA was identified by ultraviolet scanning and SDS-PAGE. The results showed that the hapten LIN was successfully linked to carrier proteins. The animal immunization results showed that three BALB/c mice indirect ELISA titer against LIN were 1 : 3 000 and the IC50 of No. 2 mice was 3. 85 μg/L and the high-titer; the rate of cross reaction of LIN mAb with Monensin was 6. 19%, and there was no cross-reactivity to other compounds; sensitivity LIN polyclonal antiserum has been generated. The artificial antigen of LIN and its mice polyclonal antiserum laid a foundation base for product the monoclonal antibodies and rapid test reagent against LIN.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)008【总页数】6页(P1-6)【关键词】林可霉素;人工抗原;合成;多抗血情【作者】张小辉;职爱民;侯玉泽;宋春美;王耀;龚芳;赵启法;张改平【作者单位】河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S859.84林可霉素（lincomycin，LIN）又称洁霉素，是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素［1－2］。

盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定

盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定张桂贤(山东临沂师范学院生命科学学院,临沂　276005)摘要:本试验旨在合成盐酸四环素人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定试验基础。

将盐酸四环素(TCH)发生霍夫曼降解和重氮化反应生成重氮盐,再与蛋白质载体(BSA,OVA)偶联生成免疫原和包被原,对偶联产物采用三氯化铁及紫外扫描法鉴定偶联成功,且免疫原和包被原的摩尔结合比分别约为3.4∶1和4.2∶1。

用免疫原免疫BALB/c小鼠,用间接EL ISA 检测抗体效价,采用竞争EL ISA法测IC50,获得了效价为1∶51200、IC50为16.91ng/mL的多克隆抗体,最终证明人工抗原制备成功。

关键词:盐酸四环素;霍夫曼;重氮化;偶联;载体中图分类号:S859.79+6 文献标识码:A 文章编号:167127236(2010)0320171204 四环素是以四并苯为母核的一类抗生素,具有抗菌谱广、毒性小和过敏反应少的特点,能抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、立克次体、病毒和原虫等(尤启冬,2004),被广泛应用于畜牧业。

但因该类药物的滥用已给动物性食品安全带来隐患,其在动物体内的残留对人类健康造成威胁。

目前动物源性食品中,四环素类抗生素的检测普遍采用高效液相色谱法(卢运战等,2006),此法操作复杂,所需试剂设备昂贵,因此不能推广,而免疫分析法具有简便、快速、准确等优点,因此建立四环素类抗生素在动物性食品中的免疫学检测法具有重要意义。

四环素类抗生素具有两性,以其盐酸盐应用最广(顾觉奋, 2001),本试验以盐酸四环素(Tet racycline hydro2 chloride,TC H)作为研究对象,合成人工抗原并免疫BALB/c小鼠获得了多克隆抗体,为该类药物单克隆抗体的制备奠定试验基础。

1　材料与方法1.1　试验材料1.1.1　主要试剂　盐酸四环素(TC H)购自北京鼎国生物公司;牛血清白蛋白(BSA)为中国医药上海化学试剂公司产品;卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司;HRP标记羊抗鼠Ig G购自北京鼎国生物公司;邻苯二胺(O PD)购自上海白鹤化工厂;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自北京鼎国生物公司。

特布他林人工抗原的制备

ｔｈｅｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓｉｓｎｅｅｄｅｄ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ｔｈｅｈａｐｔｉｎｉｓｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓＢＳＡｗｉｔｈｂｕｔａｎｅ —Ｉ，４一ｄｉｏｌｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌｅｔｈｅｒ，ａｎｄａｌｓｏ，ｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓＯＶＡｗｉｔｈＥＤＣ，ｗｈｉｃｈｍａｋｅｔｈｅａｒｔｉｉｆｃｉａｌａｎｔｉｇｅｎＴＢＬ－ＢＳＡａｎｄＴＢＬ－ＯＶＡａｃｈｉｅｖｅｄ．ＷｈａｔｉｓｎｅｘｔｉｓｔｏａｐｐｒａｉｓｅｔｈｅｓｙｎｈｅｔｔｉｃｕｓｉｎｇｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓｃａｎｎｉｎｇ．ｃｏｕｐｌｉｎｇｒａｔｉｏｉｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｔｈａｔｔｕｒｎｓｏｕｔｔｏｂｅ７．６０：１ａｎｄ７．６５：１ｒｅｓｐｅｃｉｔｖｅ－ｌｙ，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｔｈｅｅｎｄｄｒａｗｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｉｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｔｒｉｉｆｃｉａｌａｎｔｉｇｅｎＴＢＬｉｓｃａｐａｂｌｅｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅａｎｉｍａｌｓ，ｔｈａｔｌａｙｓａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙＴＢＬ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｅｒｂｕｔａｌｉｎｅ；ａｔｒｉｉｆｃａｌａｎｔｉｇｅｎ；ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ

恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定

恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定恩拉霉素人工抗原的合成过程一般可以分为以下几个步骤：原料准备、合成药物前体、合成人工抗原、纯化、结构鉴定。

下面我们将详细介绍每个步骤的具体操作。

需要准备合成恩拉霉素所需要的原料。

这包括恩拉霉素的化学品原料、溶剂等。

为了确保实验的准确性和安全性，需要使用优质的原料，并按照相关的操作规程进行准备。

接下来，合成药物前体。

恩拉霉素人工抗原的合成，一般是通过合成恩拉霉素的药物前体，再经过一系列反应转化为人工抗原。

合成药物前体是合成人工抗原的关键步骤，需要采用合适的方法和条件完成。

常用的方法包括取代反应、缩合反应等。

然后，合成恩拉霉素人工抗原。

通过在药物前体分子上引入适当的官能团，可以合成恩拉霉素人工抗原。

合成方法和条件的选择应考虑到合成的效率和选择性，同时还要注意反应的温度、溶剂等因素的控制，以保证合成反应的成功。

合成完成后，需要对人工抗原进行纯化。

合成反应通常会产生一些副产物和杂质，需要通过一系列纯化方法和步骤将其从合成产物中分离。

常用的纯化方法包括柱层析、凝胶渗透层析等。

进行结构鉴定。

结构鉴定是合成恩拉霉素人工抗原的最关键步骤之一。

常用的结构鉴定方法包括质谱、核磁共振等。

通过这些方法可以确定合成产物的结构和纯度，确保合成的人工抗原符合要求。

通过以上步骤，就可以完成恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定。

这一过程具有一定的技术难度，需要化学实验人员具备一定的化学知识和实验操作技能。

为了确保实验结果的准确性和可靠性，需要遵守实验操作的相关规范和安全要求。

恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定在药物研究和药物治疗方面具有重要的应用价值。

通过合成恩拉霉素人工抗原，可以研究其药物活性、药代动力学和药物代谢等方面的问题，为相关研究提供重要的实验依据和研究方法。

氯霉素人工抗原的合成及其结合比的测定_徐修远

氯霉素人工抗原的合成及其结合比的测定徐修远1,滑静2,胡建民1(1.沈阳农业大学,沈阳　110161;2.北京农学院生物技术系,北京　102206)摘要:以牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(H SA)为载体,采用重氮化法,合成氯霉素(CA P)的2种免疫偶合物:免疫原CA P2BSA和包被抗原CA P2H SA;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联成功与否。

结果表明,此方法不仅简便快捷,灵敏度高;还简化了合成的过程,得到了结合比较好的人工抗原。

关键词:氯霉素;免疫偶合物;紫外光谱;可见光谱;分子结合摩尔比中图分类号:R977.1 文献标识码:A 文章编号:167127236(2005)022******* 氯霉素(ch lo ram phen ico l,CA P),是一种广谱抗生素。

由于其分子质量小,不具备免疫原性,必须将它连结到蛋白质大分子上,借助大分子的T细胞表位刺激机体才能产生抗体特异性免疫应答。

过去人们认为,连接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。

试验结果证明,过多的半抗原并不一定能得到预期结果,这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时,可能不利于载体与淋巴细胞表面结合,不能使载体引起免疫应答。

一般来说,只有偶联物的结合比在20～40∶1以上才可用作免疫原;因此,为了观察和研究氯霉素特异性抗体产生的规律,就得测定其与蛋白质载体的分子结合摩尔比。

此试验根据氯霉素分子及其与蛋白质形成偶合物的特性以简单的过程合成了偶联物,采用紫外2可见分光光度法定量测定其分子结合摩尔比,为日后进行氯霉素免疫分析提供一种方法。

1　机理1.1　紫外吸收光谱法的原理　氯霉素的化学名称为D2苏式212对硝基苯基222二氯乙酰基2123丙二醇,分子式为C11H12C l2N2O5,分子量为323.13。

分子中含有取代苯环,在紫外区有一特定吸收峰。

当它连结到蛋白质载体上时,会使蛋白质的紫外吸收增强。

收稿日期:2004208212作者简介:徐修远(1975-),女,内蒙古人,硕士生,研究方向:动物生理学。

甲氧苄氨嘧啶人工抗原的合成及鉴定

结果表明，抗原ＴＭＰ和载体蛋白偶联成功。人工抗原ＢＡ—Ｔ半ＳＭＰ的成功合成，ＴＭＰ单克隆为
抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了基础。关键词：甲氧苄氨嘧啶；人工抗原；成；鉴定合
中图分类号：￥５．４８９８
ｔｅｈｐｅｈａｔｎＴＭＰｗａｕｃｓｆｌｉｋｄｔａｒｅｒｔｉｓＡｒｉｉｉｌｉｕｏｅＡ — ＴＭＰｓｓｃｅｓｕｌｌｏｃｒｉｒｐｏｅｎ．ｙｎｔｆａｍｍｎｇｎＢＳｃ
扰而抑制细菌的生长，其副作用很大，可产生过敏反应［、肝脏毒性和遗传毒性，可能有致癌性。］且
监测。目前检测ＴＭＰ残留的理化方法主要包括高效液相色谱法（Ｌ）］高效液相色谱一电喷雾串联ＨＰＣＬ、７
文献标识码：Ａ
文章编号：０４—３６（０００ —０９ —０１０２８２１）３０６４
￣ｇ１ｓ — ｎｔｅ ‘ ａｄＧｈａａｔｎｚｔｏｔＴ ‘ ｅ１ｒｍ＾ｔｔＣａｍｕｎｇｅｈｍｎ … ｒｃｅ ‘ａｌｎｏｒ厂ｒｍｔｏｐｌ ‘ ｌｌ、ｈ ‘ ｌｌ… ｌｌｌｍｏｎ
ＡｂｓｒｃＡｒｉｉｉｌｉｍｕｇｅｔａｔ：ｔｆｃａｍｎｏｎＢＳＡ —ＴＭＰｎｄＯＶＡ —ＴＭＰｗｅｅｓｔｓｚｄｕｉｇｄａｏｉａｉｎａｒｙｎｈｅｉｅｓｎｉｚｔｚｔｏｂｙｌｎｋｎｇｃｒｉｒｐｏｅｎｓＢＳＡｎｄＯＶＡｏＴＭＰ．ＴｈｍｍｕｎｇｅｉｉａｒｅｒｔｉａｔｅｉｏｎＢＳＡ —ＴＭＰｗａｄｅｉｉｄｂｓｉｎｔｆｅｙｕｔａｉｌｔｓａｉｌｒｖｏｅｃｎｎｎｇ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥｎｄａｍａｍｍｕｎｚｔｏｘｐｒｍｅｔａｎｉｌｉｉａｉｎｅｅｉｎ．Ｔｈｅｕｔｈｏｄｔａｅｒｓｌｓｓｗｅｈｔ

磺胺甲恶唑人工抗原的制备与鉴定

规模的筛选也不适用。酶联免疫吸附法（ＬＳ作为一种ＥＩＡ）免疫测定技术，不仅灵敏度高、确性好、异性强，它准特同时
还具有操作简便、速，测成本低，用于大批量样品检测快检可
多与甲氧苄啶合用，为复方磺胺甲口称恶唑（名复方新诺又明）抗菌作用可增强数倍至数十倍。磺胺甲口，恶唑在畜禽疾病的控制和治疗中发挥着重要的作用 … ，合理使用使其残不留对食品安全特别是动物源性食品安全和人类身体健康具有潜在危害性。因此，国对磺胺类药物在动物性食品中的各残留都有规定，国和欧盟国家制定的动物源性食品Ｓ美ＭＺ最高残留限量为０１ｔ／［，，国农业部从２０．ｇｇ我ｚ０５年起，把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继盐酸克伦特罗之后的又一个重点予以监控。传统的磺胺类药物残留分析利用气相色谱法、效液相高色谱法、谱法 “ 理化方法进行定性定量分析，些方法结质这果准确、敏。但是这些方法检测样品处理烦琐费时，本灵成
郭尧君ｌ介绍的方法配制各种电泳溶液，缩胶浓度５，９）浓％分离胶浓度１％，缩胶电压１０Ｖ，离胶电压６上样２浓２分０Ｖ，量为２ｌ考马斯亮蓝染色３，脱色液中脱色过夜。０，～４ｈ置用紫外凝胶成像系统分析软件估算ＢＡ与ＳｓＭＺ的分子定、用方便、格低廉、有广谱抗菌其使价具

恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定

恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定
合成方法采用正硕磷酸三乙酯与恩拉霉素进行酯化反应。

反应过程中加入新鲜的偶氮
二异丙酰胺（DIAD）作为活化剂，加速酯化反应的进行。

反应液在加入DIAD后，在室温
下搅拌12小时。

反应结束后，采用冷冻离心法对物料进行分离，得到纯化的恩拉霉素磷
酸盐酯化合物。

接下来，对纯化的磷酸盐酯化合物进行鉴定。

首先，使用高效液相色谱（HPLC）分析
纯化物的纯度，并测定其保留时间。

再通过质谱分析（MS）法对纯化合物的分子量进行测定。

在HPLC和MS的共同检测下，确保得到的恩拉霉素磷酸盐酯化合物的纯度和结构是准
确的。

最后，将合成纯化的恩拉霉素磷酸盐酯化合物与载体蛋白进行耦合，制备出完整的恩
拉霉素人工抗原。

在检测恩拉菌感染时，使用这种人工抗原能够与患者体内的恩拉菌结合，从而实现对恩拉菌进行诊断。

总之，恩拉霉素人工抗原的制备是一个复杂的过程，需要严格遵循化学制备和分析鉴
定的步骤。

这项工作的成功，可以为医药领域提供可靠的检测手段，以及更好地控制和预
防恩拉菌感染的发生。

氨苄青霉素人工抗原的合成及单克隆抗体的制备

按照常规方法，取 Sp2 /0 骨髓瘤细胞（ 1 × 107 个）与免疫脾细胞（ 1 × 108 个）在 50% PEG4000 作用下融合，置 37 ℃ 、5% CO2 培养箱培养，用 HAT 培养基选择培养融合细胞［6］。细胞融合 9 d 后，用间接 ELISA 检测细胞上清液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆。采用有限稀释法进行亚克隆 3 次，建立稳定分泌单克隆抗体的细胞株。 1. 2. 5 腹水制备及抗体纯化
SHI Lei1 ，CHENG Hua2* ，YAN Jinghui2 ，WU Meng2 ，LIU Jingze1 （ 1． College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China； 2． Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China）
取 8 周龄左右的 BALB / c 小鼠，腹腔注射 0. 3 ～ 0. 5 mL 石蜡油，7 ～ 10 d 后腹腔注入（ 5 ～ 10） × 105 个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大，用针头刺入小鼠腹部抽取腹水，采用 ProteinA 柱层析方法纯化单抗腹水［7］。使用抗体亚型试剂盒鉴定抗体亚型。 1. 2. 6 抗 AMP 单抗的特性鉴定
将合成的 AMP － KLH 完全抗原对 6 ～ 8 周龄的 BALB / c 雌性小鼠进行免疫，免疫计量均为 25 μg / 只。将合成抗原与等量弗氏佐剂（第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂）乳化均匀，采用背部多点注射法进行免疫，每隔 2 周免疫 1 次。
用间接 ELISA 检测血清效价及抑制结果。待血清效价达到 1∶ 105 ，选择血清效价高且细胞的制备及筛选

多西环素人工抗原的合成与鉴定

ａｕｎＲＡ）ｎｖｌｕｎＯＡ）ｈｃｅｅｃｕｌｙｔｓｆｒｆｉｕｏｅＯｌｍｉ（Ｓａｄｏａｍｉ（ＶｗｉｗｒｏｐｅｓｎｈｉｏｔｃａｉｎｇｎＤＸ—ＰＢｂｂｈｄｅｓａｉｌｍｍｉＡＡ—ＢＡ，Ｓ
被原ＤＸ—ＰＢＯＡＡ—ＯＡ、ＯＶＤＸ～ＯＡ，Ｖ并用紫外吸收（Ｖ）凝胶电泳（ＤＵ、ＳＳ—ＰＧ和ＥＩＡ方ＡＥ）ＬＳ
法对人工抗原进行鉴定；合成的人工抗原ＤＸ— ＡＡ— ＳＤＸ—ＢＡ分别免疫ＢＬ／将ＯＰＢＢＡ、ＯＳＡＢＣ小４（）３３，５乐涛，００，１：０～４５／４等
多西环素人工抗原的合成与鉴定
乐涛，佩峰王喜亮，延成沈亚安毕丁仁严，郭，，
（．叶农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，武汉１华１４０７；３００２信阳农业高等专科学校动物科学系，河南信阳４４０．６００）［收稿日期］０９— ９— ７［２００２文献标识码］［Ａ文章编号］０２—１８｛００）１０３１０２０２１０ — ００—０［６中图分类号］Ｑ６Ｔ４
ＳｎｈｓｓａｄＩｅｉｃｔｏｏｔｇｎｆＤｏｙｙｌｅｙｔｅｉｎｄｎｔｆａｉｎｆＡｎｉｅｓｏｘｃｃｉｉｎ
ＬＥＴａ一，ＹＡＮｅｏｔＰｉ—ｆｎ。ＷＡＮＧｅｇＸｉ—ｌａｇｉｎ，ＧＵＯｎ—ｃｅｇＹａｈｎ，ＳＨＥＮＹａ—ａ，ＢＩＤｉｇ—ｒｎｎｎｅ

兽药人工抗原的合成方法

兽药人工抗原的合成方法1兽药人工抗原的合成方法兽药人工抗原合成的基本方法为兽药半抗原与载体蛋白质的偶联。

1.1半抗原的合成大多数的兽药小分子不具有直接与载体蛋白质交联的功能团（羧基和氨基），需要通过化学合成或衍生的方法首先制备出具有活性交联功能团的相应半抗原。

理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）应具有待测物（待测的半抗原原型）的特征结构，且与载体连接后应保持该特征结构能在最大程度为免疫细胞识别和结合（能将该基团暴露）。

兽药半抗原活性基团种类主要有-NH2、-COOH、-OH、-SH，在与载体偶联制备人工抗原时，有些活性基团还需要先进行选择性保护和去保护，如阿维菌素半抗原的合成(李俊锁等，1999)。

不同的兽药有不同的半抗原活化方法，目前获得半抗原常用的方法有：对药物分子进行改造使之产生活性基团；在药物分子内部引入活泼卤元素，达到所需反应的目的；利用原形药物的代谢产物作为活泼半抗原；利用化学合成的方法合成有活性功能团的半抗原；直接购买与半抗原结构相似的有活性基团的商品化学试剂。

1.2兽药人工抗原合成常用的载体常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最为常用。

因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离于强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。

近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖较氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。

以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原尚未见报道，这应该是一个值得探讨的方向。

1.3兽药抗原的偶联方法活化的半抗原与载体偶联应根据半抗原功能团的不同，选用不同的偶联剂和不同的偶联方法。

人工抗原及免疫活性的研究——以戊二醛法三聚氰胺合成为例

白城师范学院学报Journal o£ Baicheng Normal University 第33卷第4期2019年4月Vol. 33, No. 4Apr. ,2019人工抗原及免疫活性的研究——以戊二醛法三聚氟胺合成为例王晓斐（枣庄科技职业学院医学技术系，山东滕州277599）摘要：戊二醛作为连接蛋白质与蛋白质最常用的双功能试剂，有两个对称的活性醛基，可分别与酶蛋白和免疫球蛋白上的游离氨基（酚基、咪坐基、藐基）以共价键的形式结合起来，利用这一特性,将牛血清蛋白（BSA ）与三聚氧胺偶联,合成人工抗原.这一人工合成技术以其快速且简便的特点，非常适合大量样品的检验和筛选.关键词：三聚氧胺;酶联免疫法;人工抗原；戊二醛法中图分类号:R392 文献标识码:A 文章编号：1673-3118 （2019）04-0005-040引言食品中三聚氤胺的来源主要有三个:一是被当作添加剂，向食品中违法地加入三聚氤胺来提高食品或饲料的含氮量以便在蛋白质含量上作假•二是农药通过食物链富集的过程中三聚氤胺伴随着农药扩散到环境中,又在食品的生产、加工过程中,污染食品或食品的生产原料，最终进入人体•农药中的部分功效成分在动植物体内代谢，代谢产物便是三聚氧胺•三是包装材料和餐具制作材料中含有的三聚氧胺在食物中不断转移•三聚氤胺自18世纪以来主要被作为一种工业原料使用，又因其氮含量较高被当作农作物的肥料.严把食品质量关，不仅关系到老百姓的健康，更关系到食品企业能否可持续发展•关于人工抗原及免疫活性的研究,孙凤霞等人（2018）提出利用活性酯法，以咲喃酚为起始物,利用质谱和核磁进行表征,从而合成克百威半抗原•⑴郭佳佳等人（2018）提出利用曼尼希法偶联,采用薄层色谱法进行鉴定,合成黄诺马昔人工抗原的方法•⑷武强等人（2018）提出采用非亲和纯化方法验证TRF 蛋白的免疫原性的新模式.⑶ 1三聚氧胺的合成模拟1.1 伪蛋白原理常用的蛋白质检测方法是双缩服反应即凯氏定氮法•凯氏定氮法对样品中蛋白质含量的检测是通过确定样品的含氮量折算得出•而三聚氤胺的特点便是氮含量非常高（66.7%左右），在检测蛋白质含量的实验中，三聚氤胺与蛋白质一样被浓硫酸分解释放出其中的氮原子，提高了检测出的氮含量，也就间接地 “提高” 了蛋白质含量•在三聚氧胺事件发生以前，我国国标对奶粉的检测，主要集中在蛋白质含量、脂肪含量是否达标，细菌是否致病、有没有超标等内容•而三聚氤胺作为工业原料不在食品添加剂之列，因此, 之前国标内并未包含相关的检测内容.1.2 致毒机理三聚氧胺被人体吸收易引发尿结石，其主要构成组分为1：1的三聚氧胺与三聚氧酸•在进行动物实验时，给小鼠加入MEL 与CAY 不同剂量组成的混合物,使用液-质联用的研究方法进行检测，两种物质的含量分别为9.96ixg/g,并且此时小鼠的肾脏内已经产生晶体导致了肾功能障碍.三聚氤胺致收稿日期：2019-02-28作者简介:王晓斐（1983—）,女，讲师，硕士，研究方向：微生物与免疫.白城师范学院学报第33卷第4期毒作用的器官是肾脏，因为三聚氤胺与三聚氤酸形成络合物,在人体内溶解度很小(2.2mg/L),而三聚氤胺与三聚氤酸的溶解度分别为2000mg/L和3240mg/L,所以一旦反应生成络合物便会析出以晶体形式存在•复合物的晶体在人体或动物的肾脏中不断蓄积，最终形成结石堵塞肾小管，导致尿液排出困难甚至无法排出，在肾脏中不断淤积，若作用时间过长，便会引发肾脏衰竭直至死亡.1.3动物免疫模拟首先将免疫用的三聚氧胺免疫原乳化•将三聚氧胺免疫原用高压灭菌后的无菌水配置成1mg/mL的溶液•然后与弗氏完全佐剂按1:1的体积比例混合，再将混合液放入EP管内，推拉注射器不停地将混合液吸进推出，进行乳化，直至乳化后的液体滴在水面呈球形并且10min内不扩散，方为乳化完全.免疫原乳化完成后便可以进行动物的免疫，具体操作方案如下：(1)选取健康的国内雌性Balb/c小鼠三只，一只作为阴性对照，两只准备进行免疫原的注射.(2)免疫时,首免用弗氏完全佐剂乳化三聚氧胺免疫原，在小鼠腹腔注射200piL.先把小鼠从笼子中取出,用大拇指和食指抓取小鼠耳朵附近的皮肤,再让小鼠后背贴在大拇指内侧,最后用无名指压住小鼠的尾巴根部.必要时先对小鼠进行安抚，再进行后续的操作•固定小鼠后用棉球对皮肤进行消毒，针头吸取乳化后的三聚氤胺免疫原并排除气泡，用针头穿过小鼠的腹部皮肤进入腹腔约0.5cm,将免疫原慢慢推进小鼠腹部取出针头，用棉球轻轻按住片刻.(3)二免时换用弗氏不完全佐剂进行乳化，首免完成两周后进行二免•具体方案如表1所示.表1小鼠免疫方案免疫次数抗原类型免疫剂量免疫方法首免BSA-MEL+弗氏完全佐剂100ng/只腹腔注射二免BSA-MEL+弗氏不完全佐剂100ng/只腹腔注射二免后10天进行取血•将小鼠放在笼子的盖子上，抓取并固定,用酒精棉对小鼠尾巴消毒，用剪刀剪去尾巴尖4mm,缓慢按摩小鼠尾巴使血液流出，收集血液放进1.5mL离心管内.采血完成后用棉球按压小鼠的尾尖止血，放回鼠笼•采集到的血液放于4T冰箱过夜，使用前离心.⑷2人工抗原免疫活性模拟2.1蛋白电泳模拟本实验采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行检测，根据凝胶特性即在相同条件下,分子量较大的蛋白质在凝胶中下行的更慢,外在表现就是染色后，分子量大的蛋白质条带会发生明显滞后,据此,将偶联物与其对应载体蛋白一起电泳并作对比•可以发现BSA-MEL.OVA-MEL两种偶联物与BSA、OVA两种蛋白质的标准品相比,条带明显滞后.根据SDS-PAGE凝胶的特性，说明滞后的两种偶联物比相对应的BSA.OVA分子量更大.为了更直观地了解偶联物及其对应的载体蛋白质在分子量上的差别，将BSA-MEL.OVA-MEL两种偶联物与BSA、OVA两种蛋白质的标准品同时与标准蛋白质一起电泳，进行对比.BSA-MEL(约80kDa)比BSA标准品(约70kDa)分子量更大;OVA-MEL(约60kDa)比OVA(约55kDa)标准品分子量更大,[5]通过标准蛋白质的换算，可以直观地看出分子量大小上的差异，说明人工抗原合成成功.2.2紫外扫描模拟通过粗扫描已得知扫描范围为200-400nm,扫描得到BSA、OVA、MEL、BSA-MEL、OVA-MEL各自的吸收图谱，将BSA、BSA_MEL、MEL；OVA、OVA_MEL、MEL的吸光值数据，以波长为横坐标，吸光值为纵坐标作图对比，如图1、图2所示.由图1、图2对比可以看出，偶联物的图谱与三聚氤胺和BSA(OVA)的图谱皆不重合，并表现出两者叠加的性质.人工抗原及免疫活性的研究图1三聚氧胺及其偶联物（BSA）紫外扫描图谱图2三聚氧胺及其偶联物（OVA）紫外扫描图谱2.3ELISA模拟用间接酶联免疫法测得数据如表2所示.表2ELISA测定结果种类20040080016003200640012800空白0.0830.0820.0770.0830.0880.0790.085阴性0.3110.2650.2470.2510.2140.2450.223一号鼠 1.0010.8090.7290.6030.4190.2810.121二号鼠0.9460.8370.7270.6450.4930.2930.184去除背景后绘制图表，以观察抗原的效价是否呈线性变化，以稀释倍数为横坐标，对应0D值为纵坐标，绘制图如图3所示.由图3可以看出（其中1、2、3、4、5、6、7分别为血清稀释倍数200、400、800、1600、3200、6400、12800）,小鼠血清中抗体效价的数值呈线性变化，数据有效•根据ELISA阳性判定的标准判定为两只实验小鼠的血清皆呈阳性•国阳性小鼠与阴性小鼠的抗体效价在横坐标为6,即血清稀释倍数为6400倍时接近，所以抗原效价为6400：1.3结论三聚氤胺为一种有机小分子，分子量仅为126.12,不具备免疫原性.因其具有伪蛋白原理而被违法用作增加氮含量的添加剂•本实验采用戊二醛法将三聚氧胺小分子与大分子载体蛋白BSA.OVA偶联，合成白城师范学院学报第33卷第4期图3小鼠血清中抗体效价变化图BSA-MEL.OVA-MEL,以进行利用间接ELISA法检测三聚氤胺的研究.在众多检测方法中，间接ELISA 法在面对大批量的样品检测中无疑具有优势，不仅检测速度快且精度高、检出限低,在市场监督方面具有十分可观的应用前景•本实验为三聚氧胺快速检测方法的确立提供了理论依据.参考文献：[1]孙凤霞，康立超,庞芳琴，等.克百威人工抗原合成及其免疫应用[J].西北农业学报,2018(1):65-67.[2]郭佳佳，郭艳丽，兰怡，等.黄诺马昔人工抗原合成及鉴定[J].新疆医科大学学报,2018(5)：101-104+110.[3]武强，史定刚，章玉胜.人转铁蛋白纯化制备及其抗原洁性验证[J].国际检验医学杂志,2018(7):52-58.[4]秦海艳，熊颖，黄峥，等.重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活■性检测方法的建立及验证[J].中国生物制晶学杂志,2018(1)：67-72.[5]王亚楠，王晓斐，牛琳琳，等.G族黄曲霉毒素半抗原分子设计、抗原合成及抗体特性[J].西北农业学报,2018,27(5)：626-633.[6]高蕊，詹杜清,杜明明，等.肿瘤特异性嵌合抗原受体EGFRvHI-CAR的构建及体外活性分析[J].中国生物化学与分子生物学报,2018 (2)：78-81.Study on Artificial Antigen and Immune Activity ------A Case Study of Synthesis of Melamine by Glutaraldehyde MethodWANG Xiao-fei(Department of Medical Technology,ZaoZhuang VocationalCollege of Science and Technology,Tengzhou277599,China)Abstract:Glutaraldehyde as between protein and protein is the most commonly used bifunctional reagent, there are two symmetrical active aldehyde group,respectively with enzyme protein and immunoglobulin on free a-mino(phenol,imidazole,sh)in the form of a covalent bond,using this feature,bovine serum albumin(BSA) with melamine coupling,synthesis of artificial antigens.This synthetic technique is rapid and simple,and is stdtable for the test and screening of large samples.Key Words:Melamine；Elisa；artificial antigen；Glutaraldehyde method责任编辑:李玉波。