生物化学 第5章 核酸(2)

当DNA在溶液中处于天然状态时，由于双螺旋的刚性 以及长长的线性结构，天然DNA的粘度很大，即使稀溶液 其粘度也很大。DNA变性后，由于双螺旋的刚性失去，氢 键断开，两条链彼此分开，单链分子处于随机卷曲状态， 因而粘度急剧下降。因此，DNA粘度的改变，可作为DNA分 子变性的重要指标。 二、核酸的紫外吸收特征
三
核酸的沉降特性和浮力密度：
（一）核酸的沉降特性：核酸沉降的速度与它的分子大 小及形状和结构有关。核酸的沉降系数(S) 与分子量之间 呈现对应关系。由于分子的构象对它的沉降特性有很大的 影响，故这种对应关系只是相对一定的构象而言，若分子 量相同，其构象不同，则S就不同。同一种DNA，变性后的 S要比天然的大。 沉降系数:大分子在单位离心场中的沉降速度是个定 值称为沉降系数.用s（小写）表示。蛋白质、核酸、核糖 体和病毒等的沉降系数介于1×10－13 ～100×10－13之间， 为方便起见，将10－13作为一个单位，称为斯维得贝格单 位或称沉降系数单位，用S（大写）表示。5S,就表示该分 子的沉降系数是5×10－13。
第 五 章核 酸 nucleic acid）(下)
二 DNA片段的核苷酸顺序测定
有二种极为有效的方法：链终止法(chaintermination method)和化学裂解法. 链终止法是利用5‘-脱氧核苷三磷酸（5’-dNTP）的 类似物2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（2‘,3’-ddNTP）取代 正常的底物。在DNA合成过程中，当2',3'-ddNTP 参入到延 长链中时，DNA的合成便终止。由于链终止的部位是随机的， 所以可以获得任何一种长度的DNA片段，然后通过凝胶电泳 分离，并进行放射性自显影，即可从自显影的胶片上读出 DNA片段的核苷酸顺序。
4 二氢尿嘧啶环（D环）:在三叶草结构的左侧有 一个由8－12个氨基酸残基形成的大突环，因为其中含 有二氢尿嘧啶核苷酸，所以称为D环。 5 可变环（额外环）：在TψC环和反密码环之间 有一个可变环，不同的分析不同的tRNA具有不同的可变 环，所以是tRNA分类的重要标志。分析不同来源的tRNA 结构后发现，约有15个碱基的位臵总是不变的，大约有 8个碱基的位臵是半不变的。这些不变或半不变的碱基 大多数出现在可变环中。
核酸含有嘧啶碱和嘌呤碱基，因而DNA 和RNA在紫外光 区具有吸收特性，其最大吸收在260nm处。
利用核酸和蛋白质紫外吸收差别，可鉴定核酸制品中蛋 白质杂质。例如，纯净的DNA A260:A280的比值大约介于 1.65～1.85. 若比值过高，则表明污染有RNA, 比值过低 则表明有蛋白质或酚污染。
（三） 3'-端多聚腺苷酸结构
在真核生物中,成熟的mRNA 3'-端有一段长约50— 100个或更长的腺苷酸(poly A)尾链结构。然而它的前 体的 3'-端只有一段保守的AAUAAA结构，成熟的 mRNA3'-端的poly A结构位于这段保守序列下游约10-30
个核苷酸处。显然，这段序列为腺苷酸的酶促转移、加
在核酸变性实验中，常引用摩尔磷消光系数。摩尔 磷消光系数是指含磷为1.0摩尔浓度的核酸水溶液在 260nm处的消光值,用ε(p) 表示： ε(p) = A260／C·L = A260×30.98／ W·L A: 被测核酸样品的消光值； C: 每升溶液中磷酸摩尔数； W: 每升溶液中磷的重量；30.98是磷的原子质量； L: 比色杯的内径。 核酸变性时，ε(p)值就会大大升高，当复性时， ε(p) 便降低或恢复到原来的水平，故ε(p) 可作为核 酸变性与复性的重要指标。
（二）tRNA的三级结构
tRNA可以在二级结构的基础上进一步折叠形成倒L－
行的三级结构。 tRNA复杂的三级结构是由于广泛堆积作用和螺旋臂间的 碱基配对来维持的。氨基酸的接受部位和反密码子部位分 别 位 于 倒 L- 型 的 两 端 。 tRNA 狭 长 部 分 的 宽 度 约 为 0 . 2 0.5nm,这是它们生物学功能所必需的。因为当蛋白质合成 时，两分子的tRNA必需同是结合在mRNA的两个密码子上。 tRNA的复杂的三级结构是由广泛堆积作用和螺旋臂间 的碱基配对来维持的。在这些相互作用中所涉及的大多数 碱基都属于不变和半不变的，这为所有tRNA都有相似构象 提供了基础。
顺序，简称SD顺序。该顺序与翻译起始有关， 是核糖体小亚基16SrRNA结合的部位。
（二） 5'-端甲基化的‚帽‛结构
Leabharlann Baidu
在真核生物中mRNA的5‘-端有一个甲基化的鸟苷
酸残基.这是mRNA前体在转录合成后加上去的。这种
‚帽‛结构是大多数真核生物mRNA结构上的一个重要
特征。由于真核生物中mRNA缺少SD顺序，故该特殊的 帽结构可能为真核生物mRNA翻译起始提供一个可识别 的标记,亦可阻止5’-核酸外切酶的降解。
到它的3'-端提供了加入点（或信号）。3'-端poly A结
构可以提高真核生物mRNA的稳定性。
二 转移RNA的结构
tRNA是一种能结合特定氨基酸，并能识别mRNA
上该氨基酸的密码子,将该氨基酸转运到正在合成
的蛋白质多肽链中去的接合体分子。
（一） tRNA的二级结构
tRNA是典型的单链分子，其长度约在75个核苷酸
mRNA存在于细胞质中,是基因的细胞质信使,直接指导蛋白
质的合成。
（一） 非翻译区和Shine-Dalgarno顺序 在原核生物mRNA起始密码子AUG上游约10 核苷酸处,有一段富含嘌呤核苷酸顺序,该顺序 称为前导顺序(Leading sequence) 。因Shine
Dalgarno首先发现,故又称为Shine-Dalgarno
1963年J.Vinograd等人从多瘤病毒中分离出 高纯度的DNA在进行超速离心时得到20S、16S和14S 三条不连续的带，由于是高纯度的DNA，每一条带 就应当相当于同一种分子的不同结构形式。研究发 现20S代表该分子的超螺旋形式，16S代表该分子的 松弛开环形式，14S代表该分子的线型双螺旋形式。
影响DNA变性（Tm值）的因素
1 DNA均一性 同质DNA均一性高，变性的温度范 围越窄，异质DNA变性的温度范围较宽。据此可分析DNA 的均一性 。
2 G-C含量与Tm值成正比。
不同DNA分子的Tm差别与其碱基组成有密切关系。 在标准条件下，Tm与DNA碱基组成间的关系： Tm = 69.3 + 0.41(G + C)
3 介质中离子强度 离子强度高，Tm高。测定Tm需要特定的条件：即在
入5'-dGTP类似物ddGTP,则链的延伸会在鸟苷酸残
基处终止。
三
DNA组织结构上的某些特点（略） 基因重叠（ΦΧ174） 断裂基因（外显子与内含子，鸡卵白蛋白基因） 重复序列（高度，中度重复及单一序列） 回文结构
第四节
RNA 的 结 构 与 功 能
RNA的类型和一般结构特征 除某些双股病毒RNA外,其他都是单股分子,但RNA分子可通 过自身的回折,在分子内部形成局部的双螺旋区. RNA局部的双螺旋结构与DNA的A-型结构相似，每轮螺旋约 有11个bp. 一 mRNA的结构特征
E.coli16SrRNA的结构
第五节
核 酸 的 性 质
（一）核酸的溶解性质和粘性
核酸（RNA 和DNA）都是由核苷酸组成的生物大分子，它们
含有许多极性基团，因此DNA和RNA都能溶解于水，不溶于乙醇氯仿 等有机溶剂。
在细胞内DNA和RNA通常与蛋白质结合在一起，成为DNA－蛋 白质（简称DNP）, RNA－蛋白质（简称RNP）复合体，它们在盐溶 液中的溶解度不同， DNP溶于高浓度盐溶液， RNP在低盐溶液中可 以溶解。 核酸的粘性(Viscosity) 天然DNA溶液具有很高的粘性,但当DNA变性时其粘性急剧下 降. 不规则线团比球状分子的粘度大，而线性分子的粘度比无规线 团的大。
分四组,每组加入四种5‘-dNTP(其中一种含
放射线标记)和一种2',3'-ddNTP,并加入E.coli
DNA聚合酶Ⅰ,满足DNA合成所需条件,进行该片段 互补链的合成。当加入的2',3'-ddNTP参入到链中 后,因该类似物脱氧核糖的C-3’位上无OH,不能与 下一个核苷酸连接,故链的延长被终止。例如，加
增色效应：
当DNA溶液慢慢加热到双螺旋开始解链前，在260nm 处的吸收基本保持不变。但当温度达到一定高度(一般在 750C以上)时，紫外吸收急剧增加直到两条单链完全分开 成随机卷曲状态为止。紫外吸收随变性程度加剧而升高
的现象称为高色效应或增色效应(hyper-chromoc
effect)。一般来说，DNA分子变性后，紫外吸收增高
30—40%。
减色效应
任何多聚核苷酸在260nm处都有一个特征性 的紫外吸收的最大值，但这种吸收在天然DNA分 子中，由于碱基的堆积而受到抑制，比组成双螺 旋分子的两条单链处在随机卷曲状态的吸收或核 苷酸单体的总吸收要低得多，这种现象称作低色 效应或减色效应(hypo- chromic effect)。
四 DNA的变性与复性
（一） DNA的变性
在水溶液中，双股DNA分子在某些物理因素或化学因素 的影响下，双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对间的氢键受 到破坏，严密的双股螺旋变成了两条单一的随机卷曲的多核
苷酸链，该现象称作DNA变性。
热变性是DNA的一个极其重要的性质，在研究DNA时常用到 这一性质。若将DNA稀溶液加热到80℃左右几分钟，双螺旋 结构就会受到破坏，氢键逐步断开，形成无规线团。这种变 化叫做螺旋→线团转换（helix-coil transition）.
三 核糖体RNA的结构与功能
核糖体是蛋白质合成的机构，由大小两个的亚基组成。 在原核生物中，这两个亚基分别是30S（小亚基）和50S （大亚基）。在真核生物中，这两个亚基分别是40S（小 亚基）和60S（大亚基），S表示它们在超离心时的沉降系 数。核糖体大约由65%的RNA和35%的蛋白质组成。 rRNA与功能的关系是与它们同核糖体蛋白包装或核糖 体密切相关的，与mRNA和tRNA在核糖体上结合以及mRNA的 信息翻译成新生肽链密切相关。
（二） DNA的(浮力)密度(buoyant density)
把DNA放在密度梯度介质的上面，以相当高的速度离心时， DNA在梯度中迁移，直到达到同它自己的密度相同的部位为止， 即漂浮于介质的某一密度梯度中，该部位称作DNA的(浮力)密度。 不同的DNA具有不同的(浮力)密度。可利用(浮力)密度的差别， 借助密度梯度超离心法来分离制备DNA。 DNA的(浮力)密度与其分子的碱基组成有密切的关系，与 G·C含量在一定范围内(20%--80%)呈正比关系。Schidkraut et al. 导出了下面公式： ρ = 1.660 + 0.098 ( G + C ,) DNA的(浮力)密度与其分子构象有密切的关系，与分子大小 无关。 DNA变性后，分子卷曲成致密的线团，故比天然DNA的 (浮力)密度大。
左右。根据碱基互补的原则，tRNA的多核苷酸链通 过自身的回折，可以形成类似三叶草的二级结构。 绝大多数tRNA都具有这种三叶草型的结构。
tRNA的二级结构的两个主要特征是：
1 氨基酸臂：5'端和3'端碱基互补配对形成7个bp的臂。 因该臂的3'端具有共同的、能与氨基酸结合的－pCCA－OH结构， 故该臂称作氨基酸接受臂（acceptor stem）或称氨基酸臂。 2 反密码环：在与氨基酸臂相对的另一端，有一个由7个 碱基组成的突环。该突环因顶端含有能识别mRNA密码子的反密码 子，故把这个突环称为反密码环。反密码环通过反密码臂与tRNA 的其他部分连接。 3 TψC环：在三叶草结构的右侧有一个由七个氨基酸 残基形成的突环，因为其中含有假尿嘧啶核苷酸ψ ，所以称为 TψC环。
在热变性过程中，双股螺旋被解开一半的温度称 为解链温度或融解温度(melting temperature) 或转 换温度(transition temperature)，用Tm表示。
DNA变性后的性质改变： 1 增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光 吸收度增加的现象； 2 旋光性下降； 3 粘度降低； 4 生物学功能丧失。