第11章 现代分子生物学及其技术
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标志物基因的mRNA
第三节
二、基因治疗 （一）概念
基因诊断与基因治疗
基因治疗是指向有功能缺陷的细胞导入具有相应功能的外源基因， 以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 与常规治疗的区别——常规治疗针对基因异常而表现出的各种症状，
而基因治疗针对产生疾病的根源，即异常的基因进行。
第三节
（二）分类
基因诊断与基因治疗
基因矫正治疗——基因增补、基因替换、基因修复
基因调控治疗——通过对基因表达的控制改变基因表达的强度
或方式，从而可以使由于基因异常表达引起的疾病得以治疗
总
结
分子生 物学基 本技术
1、PCR的基本反应步骤：变性、退火、延伸、循环。 2 、分子杂交技术是利用利用 DNA 变性与复性来进行 DNA或RNA 定性 定量分析的一项技术。
第一节
（一）PCR技术的工作原理
1.基本工作原理
分子生物学基本技术
按照半保留复制的原理沿着模板 链延伸直到新DNA链合成的完成，反 复重复这一过程，即可使目的DNA片 段得到扩增。
模板DNA
DNA
特异 性引物
聚合酶
原料 dNTP
第一节
模板DNA
5
分子生物学基本技术
5
5
第一次循环
引物1 5 引物2
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
多 莉 羊 的 培 育 过 程
卵细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核 融合后的卵细胞 卵裂 早期胚胎 胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
第三节
基因诊断与基因治疗
内容 提要
一、基 因诊断
二、基 因治疗
第三节
基因诊断与基因治疗
一、基因诊断——DNA诊断 （一）概念和特点 1.概念
利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测与分 析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而对疾病做出诊 断的方法。
第一节
2.印迹技术的分类
分子生物学基本技术
DNA印迹——Southern印迹
RNA印迹——Northern 印迹 蛋白质印迹——Western 印迹
Southern印迹
DNA酶切片段电泳图
Northern印迹
mRNA电泳图
Western印迹
蛋白质样品电泳图
转 印 显影
转 印 显影
转 印 显影
第二节
负 极
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
2.双脱氧链末端终止法测序的自动化
在Sanger法基础上发展起来的全自动激光荧光DNA测序技 术，可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化。 基本原理仍然是Sanger法，以荧光代替同位素进行标记，反 应产物经电泳后，利用激光激发DNA片段上的荧光发色基团而 显现荧光，通过检测器采集荧光信号，经计算机进行储存和进一 步处理，在荧光屏上显示出每个样品经电泳分离后DNA片段排 列情况的模拟图像，即DNA序列。
第一节
分子生物学基本技术
（二）探针的种类及其制备 1.概念
经过特殊标记的已知序列的核酸（或寡核苷酸）单链（或双链） 片段，用来检测某一特定核苷酸序列的核酸（DNA或RNA）片段。 用于分子杂交的探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是 克隆的基因组DNA、cDNA全长或部分片段。
第一节
2.探针的种类
5
5
5
第二次循环 5 5 5 5 5
5
5
5
5
第一节
5 5 5 5
分子生物学基本技术
第三次循环 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5
5
25～40 次循环后，模板DNA的含量可以 扩大100万倍以上。
第一节
2.PCR反应体系
模板DNA 特异性引物 耐热的DNA聚合酶 dNTP Mg2+
DNA序列自动分析原理及结果图
绿色 荧光
蓝色 荧光 红色 荧光
ddG ddA ddT ddC
黄色 荧光
电泳
第二节
（二）进展
分子生物学延伸拓展类技术
第一代测序技术——双脱氧链末端终止法 第二代测序技术——高通量测序技术 第三代测序技术——纳米孔的单分子测序技术
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
三、转基因技术与核移植技术 （一）转基因技术的概念 概念
将外源基因导入受体动物染色体基因组内，使外源基因稳定 整合并能遗传给后代的技术。 由此构建的动物称为转基因动物。
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（二）转基因技术的基本流程
外源目的基因的获得 外源目的基因的有效导入 胚胎培养与移植 外源目的基因表达的检测等
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（三）培育转基因动物的主要方法 基因显微注射法 胚胎干细胞介导法 精子载体导入法
分子生物学基本技术
第一节
（二）PCR的基本反应步骤
分子生物学基本技术
25~40次循环， 扩增百万倍
变性 95˚C
循环
延伸 72˚C
退火 55˚C
第一节
（三）PCR技术的主要用途
分子生物学基本技术
1.PCR技术在生物医学研究中的应用
目的基因的获得 核酸的定量分析
第一节
分子生物学基本技术
2.PCR技术在体外诊断方面的应用 临床诊断——单基因遗传病、肿瘤、感染性疾病病原体的检测 法医刑侦——亲子鉴定 检验检疫——出入境检验检疫
生物化学基础
艾旭光制作
第十一章 现代分子生物学及其技术
人民卫生出版社
刘苗制作
第十一章
现代分子生物学及其技术
第一节
分子生物学基本技术
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
第三节
基因诊断与基因治疗
学 习 目 标
1．熟悉聚合酶链式反应、分子杂交、基因 工程、DNA测序技术的概念和意义。
2．了解印迹技术、转基因技术与核移植技术 的概念，基因诊断和基因治疗的临床意义。
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（三）基因工程的基本过程
① 分离含有目的基因的DNA片段，经限制性内切酶作用后，制作重组 DNA分子 ② 选择或改造载体DNA分子，限制性内切酶作用后，制作重组DNA分子 ③ 将含有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制且含有选择标记的载 体DNA分子上，形成重组DNA分子
第一节
内容 提要
一.聚合酶 链反应技术
分子生物学基本技术
二. 分 子杂交 技术
三.印迹 技术
第一节
分子生物学基本技术
一、聚合酶链反应技术（PCR）
PCR技术是一种在体外对特定DNA片段进行高效扩增的技术，通 过这个反应，可以将特定的微量靶DNA片段扩增至十万及至百 万倍。
优点：
敏感性强 特异性高 重复性好及其快速简便
第一节
三、印迹技术
分子生物学基本技术
（一）基本概念
将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定方式转移并固定至尼 龙膜等支持载体上的一种方法，类似用吸墨纸吸收纸张上的墨迹。
第一节
（二）印迹技术与分类 1.印迹技术 DNA印迹技术包括
分子生物学基本技术
将待测定的DNA样品通过合适的方法转移并结合至某种固相支持物 探针的标记与制备 固定于固相支持物上的样品与标记的探针在一定的温度和离子强度 下退火 杂交信号的检测与结果分析
小结
分子生物 学延伸拓展 类技术
1、基因工程又称DNA重组技术，过程中需用到多种工具酶。 2、DNA序列的测定即DNA一级结构的测定。
基因诊 断与基 因治疗
1、基因诊断可直接检测分析基因类型和缺陷及其表达功能是否正 常。 2、基因治疗主要包括基因矫正治疗和基因调控治疗。
第四节
练 习 题（单选）
1.在基因工程实验中，DNA重组体是（ ） A．不同来源的的两段DNA单链的复性 B．目的基因与载体的连接物 C．原核DNA与真核DNA的连接物 D．两个不同的结构基因形成的连接物 2.下列对聚合酶链反应技术的优点叙述错误的是（ ） A．敏感性强 B．特异度高 C．快速简便 D．重复性好 E．实用性差 3.以下哪项不属于基因工程的工具酶（ ） A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．反转录酶 D．RNA聚合酶 4.可识别并切割特异DNA序列的酶是（ ） A．限制性核酸外切酶 B.限制性核酸内切酶 C．核酶 D．反转录酶 E．耐热DNA聚合酶
第三节
2.特点
基因诊断与基因治疗
基因作为检测目标，属于“病因诊断”，针对性强 应用特定基因序列作为探针，特异性高 分子杂交和PCR具有放大效应，样本用量少，灵敏度高 诊断取材方便，适应性强，诊断范围广
第三节
（二）临床应用
基因诊断与基因治疗
遗传病——为防治遗传病和优生优育具有重大意义 感染性与传染性疾病——灵敏度高、特异性强、快速简便 恶性肿瘤——检测肿瘤相关基因、检测肿瘤相关病毒基因、检测肿瘤
第一节
二、分子杂交技术
分子生物学基本技术
分子杂交技术是利用DNA变性与复性来进行DNA或RNA定 性或定量分析的一项技术。
第一节
分子生物学基本技术
（一）分子杂交与分子杂交技术 1.分子杂交
一般指核酸分子杂交，核酸分子在变性后再复性的过程中， 来源不同但互补配对的DNA或RNA单链相互结合形成杂合双 链的特性或现象 。 变性和复性是核酸分子的基本性质，其基础是碱基配对规律。
第二节
（四）核移植技术 概念
分子生物学延伸拓展类技术
即动物整体克隆技术，是将动物早期胚胎或体细胞细胞核移 植到去核受精卵或成熟卵母细胞中，重新构建新的胚胎，然后发 育成个体 。
产生的个体所携带的遗传性状仅来自父亲或母亲，恰似无性繁 殖，从遗传学角度看，是一个个体的完全拷贝，因此称之为克隆。
Ａ母绵羊
④ 将重组DNA分子导入受体细胞（宿主细胞），并增殖
⑤ 从细胞繁殖群体中筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆扩增，进一 步提取、纯化重组DNA
基因工程基本步骤示意图
抗生素 抗性基因 载体 酶切
＋Βιβλιοθήκη Baidu
酶切位点
目的基因
重组DNA分子
酶切
纯化
退火
导入 扩增 培养
细菌 繁殖 筛选 抗生素培养 基上生长
第二节
二、DNA测序技术 （一）基本原理
分子生物学延伸拓展类技术
1.双脱氧链末端终止法——Sanger法
利用DNA复制机制，利用2´,3´-双脱氧核苷酸部分替代正常2´脱氧核苷酸作为底物进行DNA合成，在DNA合成时，由于ddNTP的 脱氧核糖的3´-C上缺少羟基而不能与下一个核苷酸的5´-C上的磷酸 基之间形成3´,5´-磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此 ddNTP处终止。这样同一ddNTP就形成了一个长短不同的DNA链系 列，四种ddNTP形成四个不同碱基、不同长度系列的DNA。经过标 记的dNTP被合成为四个系列的DNA，进行高分辨率的变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳，根据电泳结果读出DNA一级结构的碱基排序 。
分子生物学延伸拓展类技术
内容 提要
一、基 因工程
二、DNA测 序技术
第二节
一、基因工程
分子生物学延伸拓展类技术
（一）基因工程的概念
狭义的基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体 分子在体外进行拼接重组，转入另一生物体（受体）细胞 内，使之扩增并表达出新的性状。 广义的基因工程分为上游技术和下游技术。
功 能
基因工程中常用的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA-polⅠ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
识别特异序列，切割DNA 连接外源DNA与基因载体，构建重组DNA分子 合成双链cDNA的第二条链 合成cDNA 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
第一节
分子生物学基本技术
变性
杂 交 复性
RNA
DNA
第一节
2.分子杂交技术
分子生物学基本技术
在DNA复性过程中，如果把不同DNA，或DNA与RNA混在一 起，只要DNA或RNA的单链分子之间存在着一定的碱基配对 关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，据此对核酸分子 进行定性和定量的分析。 通常将一种已知序列核酸单链（探针）有同位素或非同位素 （生物素或荧光染料）标记，再与另一种核酸单链进行分子杂 交，通过对探针的检测而实现对未知核酸分子的检测和分析。
双脱氧链末端终止法测定DNA序列示意图
3´ 5´ 3´
ATCGGTACCGT
dGTP dCTP dTTP dATP
5´
+
+
+
+
ddGTP
ddCTP
ddTTP
ddATP
正 极
G
C
T
A 3´ TAGCCATGGCA TAGCCATGGC TAGCCATGG TAGCCATG TAGCCAT TAGCCA TAGCC TAGC TAG TA T 5´
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（二）基因工程的工具酶
以DNA分子为工作对象，对DNA分子进行切割、连接、聚合等 操作中所需要的酶称为工具酶。
限制性核酸内切酶——能够识别DNA的特异序列并在识别的位点 及周围进行切割双链DNA的一类内切酶，被称为基因工程的手术刀。
第二节
工具酶
分子生物学延伸拓展类技术
分子生物学基本技术
放射性同位素标记探针 非放射性同位素标记探针
——生物素标记探针
地高辛标记探针
荧光素标记探针
第一节
3.探针的制备 合成 标记 纯化
分子生物学基本技术
第一节
1.概念
分子生物学基本技术
（三）分子杂交技术的发展
1961年，Hall等将探针与靶序列在溶液中杂交（液相杂交），过 程烦琐，准确性差； 1962年Bolton等设计了一种简单的固相杂交方法，将变性DNA 固定在琼脂中，与其它互补核酸序列杂交； 二十世纪七十年代，限制性内切酶、印迹技术、寡核苷酸自动合 成技术的发展和应用，使分子杂交技术得到完善和广泛应用。
第三节
二、基因治疗 （一）概念
基因诊断与基因治疗
基因治疗是指向有功能缺陷的细胞导入具有相应功能的外源基因， 以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 与常规治疗的区别——常规治疗针对基因异常而表现出的各种症状，
而基因治疗针对产生疾病的根源，即异常的基因进行。
第三节
（二）分类
基因诊断与基因治疗
基因矫正治疗——基因增补、基因替换、基因修复
基因调控治疗——通过对基因表达的控制改变基因表达的强度
或方式，从而可以使由于基因异常表达引起的疾病得以治疗
总
结
分子生 物学基 本技术
1、PCR的基本反应步骤：变性、退火、延伸、循环。 2 、分子杂交技术是利用利用 DNA 变性与复性来进行 DNA或RNA 定性 定量分析的一项技术。
第一节
（一）PCR技术的工作原理
1.基本工作原理
分子生物学基本技术
按照半保留复制的原理沿着模板 链延伸直到新DNA链合成的完成，反 复重复这一过程，即可使目的DNA片 段得到扩增。
模板DNA
DNA
特异 性引物
聚合酶
原料 dNTP
第一节
模板DNA
5
分子生物学基本技术
5
5
第一次循环
引物1 5 引物2
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
多 莉 羊 的 培 育 过 程
卵细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核 融合后的卵细胞 卵裂 早期胚胎 胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
第三节
基因诊断与基因治疗
内容 提要
一、基 因诊断
二、基 因治疗
第三节
基因诊断与基因治疗
一、基因诊断——DNA诊断 （一）概念和特点 1.概念
利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测与分 析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而对疾病做出诊 断的方法。
第一节
2.印迹技术的分类
分子生物学基本技术
DNA印迹——Southern印迹
RNA印迹——Northern 印迹 蛋白质印迹——Western 印迹
Southern印迹
DNA酶切片段电泳图
Northern印迹
mRNA电泳图
Western印迹
蛋白质样品电泳图
转 印 显影
转 印 显影
转 印 显影
第二节
负 极
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
2.双脱氧链末端终止法测序的自动化
在Sanger法基础上发展起来的全自动激光荧光DNA测序技 术，可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化。 基本原理仍然是Sanger法，以荧光代替同位素进行标记，反 应产物经电泳后，利用激光激发DNA片段上的荧光发色基团而 显现荧光，通过检测器采集荧光信号，经计算机进行储存和进一 步处理，在荧光屏上显示出每个样品经电泳分离后DNA片段排 列情况的模拟图像，即DNA序列。
第一节
分子生物学基本技术
（二）探针的种类及其制备 1.概念
经过特殊标记的已知序列的核酸（或寡核苷酸）单链（或双链） 片段，用来检测某一特定核苷酸序列的核酸（DNA或RNA）片段。 用于分子杂交的探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是 克隆的基因组DNA、cDNA全长或部分片段。
第一节
2.探针的种类
5
5
5
第二次循环 5 5 5 5 5
5
5
5
5
第一节
5 5 5 5
分子生物学基本技术
第三次循环 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5
5
25～40 次循环后，模板DNA的含量可以 扩大100万倍以上。
第一节
2.PCR反应体系
模板DNA 特异性引物 耐热的DNA聚合酶 dNTP Mg2+
DNA序列自动分析原理及结果图
绿色 荧光
蓝色 荧光 红色 荧光
ddG ddA ddT ddC
黄色 荧光
电泳
第二节
（二）进展
分子生物学延伸拓展类技术
第一代测序技术——双脱氧链末端终止法 第二代测序技术——高通量测序技术 第三代测序技术——纳米孔的单分子测序技术
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
三、转基因技术与核移植技术 （一）转基因技术的概念 概念
将外源基因导入受体动物染色体基因组内，使外源基因稳定 整合并能遗传给后代的技术。 由此构建的动物称为转基因动物。
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（二）转基因技术的基本流程
外源目的基因的获得 外源目的基因的有效导入 胚胎培养与移植 外源目的基因表达的检测等
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（三）培育转基因动物的主要方法 基因显微注射法 胚胎干细胞介导法 精子载体导入法
分子生物学基本技术
第一节
（二）PCR的基本反应步骤
分子生物学基本技术
25~40次循环， 扩增百万倍
变性 95˚C
循环
延伸 72˚C
退火 55˚C
第一节
（三）PCR技术的主要用途
分子生物学基本技术
1.PCR技术在生物医学研究中的应用
目的基因的获得 核酸的定量分析
第一节
分子生物学基本技术
2.PCR技术在体外诊断方面的应用 临床诊断——单基因遗传病、肿瘤、感染性疾病病原体的检测 法医刑侦——亲子鉴定 检验检疫——出入境检验检疫
生物化学基础
艾旭光制作
第十一章 现代分子生物学及其技术
人民卫生出版社
刘苗制作
第十一章
现代分子生物学及其技术
第一节
分子生物学基本技术
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
第三节
基因诊断与基因治疗
学 习 目 标
1．熟悉聚合酶链式反应、分子杂交、基因 工程、DNA测序技术的概念和意义。
2．了解印迹技术、转基因技术与核移植技术 的概念，基因诊断和基因治疗的临床意义。
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（三）基因工程的基本过程
① 分离含有目的基因的DNA片段，经限制性内切酶作用后，制作重组 DNA分子 ② 选择或改造载体DNA分子，限制性内切酶作用后，制作重组DNA分子 ③ 将含有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制且含有选择标记的载 体DNA分子上，形成重组DNA分子
第一节
内容 提要
一.聚合酶 链反应技术
分子生物学基本技术
二. 分 子杂交 技术
三.印迹 技术
第一节
分子生物学基本技术
一、聚合酶链反应技术（PCR）
PCR技术是一种在体外对特定DNA片段进行高效扩增的技术，通 过这个反应，可以将特定的微量靶DNA片段扩增至十万及至百 万倍。
优点：
敏感性强 特异性高 重复性好及其快速简便
第一节
三、印迹技术
分子生物学基本技术
（一）基本概念
将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定方式转移并固定至尼 龙膜等支持载体上的一种方法，类似用吸墨纸吸收纸张上的墨迹。
第一节
（二）印迹技术与分类 1.印迹技术 DNA印迹技术包括
分子生物学基本技术
将待测定的DNA样品通过合适的方法转移并结合至某种固相支持物 探针的标记与制备 固定于固相支持物上的样品与标记的探针在一定的温度和离子强度 下退火 杂交信号的检测与结果分析
小结
分子生物 学延伸拓展 类技术
1、基因工程又称DNA重组技术，过程中需用到多种工具酶。 2、DNA序列的测定即DNA一级结构的测定。
基因诊 断与基 因治疗
1、基因诊断可直接检测分析基因类型和缺陷及其表达功能是否正 常。 2、基因治疗主要包括基因矫正治疗和基因调控治疗。
第四节
练 习 题（单选）
1.在基因工程实验中，DNA重组体是（ ） A．不同来源的的两段DNA单链的复性 B．目的基因与载体的连接物 C．原核DNA与真核DNA的连接物 D．两个不同的结构基因形成的连接物 2.下列对聚合酶链反应技术的优点叙述错误的是（ ） A．敏感性强 B．特异度高 C．快速简便 D．重复性好 E．实用性差 3.以下哪项不属于基因工程的工具酶（ ） A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．反转录酶 D．RNA聚合酶 4.可识别并切割特异DNA序列的酶是（ ） A．限制性核酸外切酶 B.限制性核酸内切酶 C．核酶 D．反转录酶 E．耐热DNA聚合酶
第三节
2.特点
基因诊断与基因治疗
基因作为检测目标，属于“病因诊断”，针对性强 应用特定基因序列作为探针，特异性高 分子杂交和PCR具有放大效应，样本用量少，灵敏度高 诊断取材方便，适应性强，诊断范围广
第三节
（二）临床应用
基因诊断与基因治疗
遗传病——为防治遗传病和优生优育具有重大意义 感染性与传染性疾病——灵敏度高、特异性强、快速简便 恶性肿瘤——检测肿瘤相关基因、检测肿瘤相关病毒基因、检测肿瘤
第一节
二、分子杂交技术
分子生物学基本技术
分子杂交技术是利用DNA变性与复性来进行DNA或RNA定 性或定量分析的一项技术。
第一节
分子生物学基本技术
（一）分子杂交与分子杂交技术 1.分子杂交
一般指核酸分子杂交，核酸分子在变性后再复性的过程中， 来源不同但互补配对的DNA或RNA单链相互结合形成杂合双 链的特性或现象 。 变性和复性是核酸分子的基本性质，其基础是碱基配对规律。
第二节
（四）核移植技术 概念
分子生物学延伸拓展类技术
即动物整体克隆技术，是将动物早期胚胎或体细胞细胞核移 植到去核受精卵或成熟卵母细胞中，重新构建新的胚胎，然后发 育成个体 。
产生的个体所携带的遗传性状仅来自父亲或母亲，恰似无性繁 殖，从遗传学角度看，是一个个体的完全拷贝，因此称之为克隆。
Ａ母绵羊
④ 将重组DNA分子导入受体细胞（宿主细胞），并增殖
⑤ 从细胞繁殖群体中筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆扩增，进一 步提取、纯化重组DNA
基因工程基本步骤示意图
抗生素 抗性基因 载体 酶切
＋Βιβλιοθήκη Baidu
酶切位点
目的基因
重组DNA分子
酶切
纯化
退火
导入 扩增 培养
细菌 繁殖 筛选 抗生素培养 基上生长
第二节
二、DNA测序技术 （一）基本原理
分子生物学延伸拓展类技术
1.双脱氧链末端终止法——Sanger法
利用DNA复制机制，利用2´,3´-双脱氧核苷酸部分替代正常2´脱氧核苷酸作为底物进行DNA合成，在DNA合成时，由于ddNTP的 脱氧核糖的3´-C上缺少羟基而不能与下一个核苷酸的5´-C上的磷酸 基之间形成3´,5´-磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此 ddNTP处终止。这样同一ddNTP就形成了一个长短不同的DNA链系 列，四种ddNTP形成四个不同碱基、不同长度系列的DNA。经过标 记的dNTP被合成为四个系列的DNA，进行高分辨率的变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳，根据电泳结果读出DNA一级结构的碱基排序 。
分子生物学延伸拓展类技术
内容 提要
一、基 因工程
二、DNA测 序技术
第二节
一、基因工程
分子生物学延伸拓展类技术
（一）基因工程的概念
狭义的基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体 分子在体外进行拼接重组，转入另一生物体（受体）细胞 内，使之扩增并表达出新的性状。 广义的基因工程分为上游技术和下游技术。
功 能
基因工程中常用的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA-polⅠ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
识别特异序列，切割DNA 连接外源DNA与基因载体，构建重组DNA分子 合成双链cDNA的第二条链 合成cDNA 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
第一节
分子生物学基本技术
变性
杂 交 复性
RNA
DNA
第一节
2.分子杂交技术
分子生物学基本技术
在DNA复性过程中，如果把不同DNA，或DNA与RNA混在一 起，只要DNA或RNA的单链分子之间存在着一定的碱基配对 关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，据此对核酸分子 进行定性和定量的分析。 通常将一种已知序列核酸单链（探针）有同位素或非同位素 （生物素或荧光染料）标记，再与另一种核酸单链进行分子杂 交，通过对探针的检测而实现对未知核酸分子的检测和分析。
双脱氧链末端终止法测定DNA序列示意图
3´ 5´ 3´
ATCGGTACCGT
dGTP dCTP dTTP dATP
5´
+
+
+
+
ddGTP
ddCTP
ddTTP
ddATP
正 极
G
C
T
A 3´ TAGCCATGGCA TAGCCATGGC TAGCCATGG TAGCCATG TAGCCAT TAGCCA TAGCC TAGC TAG TA T 5´
第二节
分子生物学延伸拓展类技术
（二）基因工程的工具酶
以DNA分子为工作对象，对DNA分子进行切割、连接、聚合等 操作中所需要的酶称为工具酶。
限制性核酸内切酶——能够识别DNA的特异序列并在识别的位点 及周围进行切割双链DNA的一类内切酶，被称为基因工程的手术刀。
第二节
工具酶
分子生物学延伸拓展类技术
分子生物学基本技术
放射性同位素标记探针 非放射性同位素标记探针
——生物素标记探针
地高辛标记探针
荧光素标记探针
第一节
3.探针的制备 合成 标记 纯化
分子生物学基本技术
第一节
1.概念
分子生物学基本技术
（三）分子杂交技术的发展
1961年，Hall等将探针与靶序列在溶液中杂交（液相杂交），过 程烦琐，准确性差； 1962年Bolton等设计了一种简单的固相杂交方法，将变性DNA 固定在琼脂中，与其它互补核酸序列杂交； 二十世纪七十年代，限制性内切酶、印迹技术、寡核苷酸自动合 成技术的发展和应用，使分子杂交技术得到完善和广泛应用。