聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应-2011 分子生物学
3’
G
C 3’
5’
5’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列 定点突变 探针标记
引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3.引物的使用要求
• 引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物 的浓度0.1～ 0.5 µ mol，以最低引物量产生所 需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配 和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二 聚体的机会。 • 合适的退火温度比引物本身的Tm低 5 ℃， 一般在 55 ℃ 左右。
4) 引物设计决定PCR反应的成败。
2. 引物设计的基本要求 1）引物长度要合适，一般为16～30个核 苷酸，常用20bp左右。
• 引物过短：会影响PCR的特异性；
• 引物过长：需提高相应的退火温度，若 则影响PCR反应产物。
超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度，
2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物 与模板的结合。G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。 3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出现3 个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排 列，最好随机分布。否则易使引物与模板 的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。 4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成 发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免 形成引物二聚体。
2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.
(四) Taq酶的最适温度
75~80℃每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒，70℃ 延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为22个核苷酸/秒。 最适温度75℃左右。
（四）原料
• 原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度为
20~200µ mol/L。
（五） Mg2+
聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction
Taq
l R 5’
Annealing
Denaturation
Q 3’
TaqManTM
Q
R
3’
5’
5’
Q 3’ 5’
Q 3’ 5’
Taqቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3’ 5’
Taq
3’ 5’
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’ 2. Cleavage 3’
（PCR-sequence specific oligonucleotide probe, SSOP） 序列特异性引物扩增技术
（PCR-sequence specific primer, SSP）
PCR技术在法医学上的应用
个人认识 亲子鉴定 性别鉴定
END
可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。
PCR反应的特点
特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性
灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平
简便、快速 2～4 小时完成扩增
对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板
相对定量PCR
理论值 实际值
设计相对定量PCR实验方案时须注意： 预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所
采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效应。
“管家基因”与靶基因同管扩增，扩增产 物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者 分离开。
绝对定量 PCR
1. 外参照系统的设置 2. 内参照系统的设置
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
PCR
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化 的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增 反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特 异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异 的扩增条带。
二、退火 模板DNA与引物的退火（复性），模板 DNA经加热变性成单链后，温度降低至 55℃左右，引物与模板DNA单ห้องสมุดไป่ตู้的互补序 列配对结合。
三、延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，dNTP为反应原料靶序列为模板 ，按碱基配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板DNA链。
简并pcr名词解释
简并PCR什么是PCR？•PCR，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学中常用的技术，用于在体外大规模扩增（amplify）DNA片段。
PCR的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆尔和诺贝尔化学奖得主基里尔·穆尔。
PCR技术的发明对于现代生物学和基因工程领域做出了极其重要的贡献。
PCR的基本原理PCR基于DNA的复制原理，通过三步循环反应来扩增特定的DNA片段。
主要包括以下步骤：1.变性（Denaturation）：将PCR反应体系中的DNA双链解开成两条单链。
这一步需要高温（通常为94-98℃）来使DNA变性，即断开氢键，使DNA成为单链。
2.退火（Annealing）：在较低温度下（通常为50-65℃），引入名为引物（primer）的寡核苷酸序列，使其与特定的目标DNA序列的两个侧链互补配对。
引物是特定长度的DNA片段，它可以指定需要扩增的目标DNA序列的起始点。
3.延伸（Extension）：在适合特定DNA聚合酶（例如，Taq聚合酶）活性的温度下（通常为72℃），DNA聚合酶会按照引物的互补序列将新的核苷酸加入到引物的3’端，从而合成新的DNA链。
延伸的结果是获得了与目标DNA片段相同碱基序列的双链DNA，这两条DNA链具有互补链。
这三个步骤被循环重复数次，每次循环被称为一个“PCR循环”。
每个PCR循环都会使目标DNA片段的数量成倍增加。
通常情况下，进行30-40个PCR循环就可以获得足够多的目标DNA。
简并PCR的概念简并PCR（Degenerate PCR），也称为混合PCR（Multiplex PCR），是PCR的一种变体。
PCR中的引物通常是一对特定的引物，用于扩增目标DNA的特定序列。
而在简并PCR中，引物序列中的一些位置可以有多个可能的碱基，这些碱基任意的组合将允许引物同时识别和扩增多个相关目标序列。
简并PCR可以用于扩增不同物种、不同基因亚型或具有高度变异的基因等多样的DNA序列。
第七课 聚合酶链式反应(PCR)
PCR反应体系
3．引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1umol/L。引物设计一般 要考虑以下几个问题：
① 引物的特异性。长度至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般 会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性；过长的引物会造成 Tm值太高而不利于PCR扩增。
② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好小于2-5℃ 。这样 可使两条引物在相同的温度下与摸板DNA退火同时达到较高效率。对 于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G C） + 2（A T）。
PCR反应体系
5．DNA 聚合酶
③ Vent DNA 聚合酶 Vent DNA 聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌 Thermococcus litoralis 中分离的第一个具有 3'-5' 外切活性的高温 DNA 聚合
酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。酶分子为 85kDa ， 具有更长的半衰期，在 100℃（使用 MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小时。
– 缓冲液中还含有 50mM 的钾离子，以促进引物退火 。有些 缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富 含 G C 模板的扩增效率。
PCR反应体系
2．脱氧核苷三磷酸（dNTP） 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ， 即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一 般为 200 M。 dNTP 的浓度过高会影响产物 特异性和忠实性。4种dNTP的浓度要相等( 等 摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几 种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低 又会降低PCR产物的产量。
最新聚合酶链式反应PCR
94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。
五、PCR反应条件优化：
1、温度、循环参数：
⑴ 变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成 功的关键。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子 也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可 使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃， 30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越 低，产物特异性越低。
一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板 之间完全结合。
2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应 的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非 特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下 降。
3. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
0.02 ～ 0.2 mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度 与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增特异性DNA片段的技术。
经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
一、PCR基本原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR扩增靶DNA的过程类似于体内DNA的半保留复制，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
利用人工合成的一对寡核苷酸引物，分别与待扩增DNA片段的两侧翼序列互补，在DNA聚合酶催化下，以靶DNA序列为模板，四种dNTP为原料，经过高温变性、低温退火和中温延伸“三步曲”的循环，使靶DNA片段经过30个循环周期后达到百万倍的扩增。
简述pcr原理及过程
简述pcr原理及过程
PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，它是利用特定片段的特异性引物，引发特定基因的扩增反应，是一种灵敏、可重复、可控制的DNA增幅技术。
PCR反应可分为4个步骤：
1、反应起始：首先将样品（DNA）添加到聚合酶反应管中，并加入引物、DNA聚合酶和dNTP（双脱氧核糖核苷），通常将温度升至
94~95℃，使反应管中的核苷酸发生融合，这一部分反应过程也称为DNA断裂步骤。
2、反应过程：将温度降至适当的值（通常为55～65℃），令反应管中的引物特异性结合到目标模板DNA的3'端。
然后，聚合酶将新合成的DNA片段扩增至模板DNA中，在一次反应周期中，每个特异性引物和模板DNA扩增的DNA片段都有两对成对分子。
3、反应终止：将反应温度升至72℃，聚合酶分解，使扩增的反应终止。
4、循环反复：将上述3步反应重复30～40次，可使初始的片段扩增指数级增加，最终可以得到大量的片段。
- 1 -。
简述PCR反应的原理及其应用
简述PCR反应的原理及其应用
PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外扩增DNA 的方法，它通过反复复制DNA模板，快速并特异地增加目标DNA的数量。
PCR 反应的原理主要有三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在PCR反应开始时，将目标DNA加热至95C，使其双链DNA变性为单链DNA。
这一步骤中，双链DNA的氢键断裂，两条链分离。
2. 退火：将温度降至50-65C，使引物与目标DNA序列互相结合。
引物是两条质粒模板DNA链的两段DNA链（5’末端向3’末端延伸）。
退火温度要与引物的序列和碱基配对的目标DNA序列的G和C含量相匹配。
引物与目标DNA 序列互补结合。
3. 延伸：将温度升高至72C，引物的3’端为DNA聚合酶提供延伸合成DNA 的模板。
DNA聚合酶将适当的核苷酸与模板上的目标DNA序列配对，形成新的DNA链。
此过程被称为延伸。
通过不断重复这些步骤，每次扩增都会产生原有DNA模板的复制产品。
每个PCR循环都会将DNA数目倍增。
因此，经过多个PCR循环后，从少量的起始DNA模板可以扩增高达数百万个拷贝。
PCR反应是一项重要的分子生物学技术，广泛应用于基因测序、遗传疾病的诊
断、DNA指纹鉴定、基因突变分析等领域。
它可以快速、高效地扩增目标DNA 序列，从而使其能够被有效地检测和分析。
同时，PCR反应还被用于DNA克隆、基因工程和其他实验室研究中。
聚合酶链式反应（PCR）实验方法
聚合酶链式反应（PCR）实验方法聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应科技名词定义中文名称：聚合酶链式反应英文名称：polymerase chain reaction;PCR定义1：用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。
所属学科：生态学(一级学科) ；分子生态学(二级学科)定义2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。
所属学科：水产学(一级学科) ；水产生物育种学(二级学科)定义3：通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。
所属学科：细胞生物学(一级学科) ；细胞生物学技术(二级学科)定义4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。
所属学科：遗传学(一级学科) ；分子遗传学(二级学科)本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
目录[隐藏][概述]［PCR原理］[PCR反应体系与反应条件]［PCR步骤］［PCR检测］［PCR反应特点］［PCR的循环参数］[PCR仪器][概述]［PCR原理］[PCR反应体系与反应条件]［PCR步骤］［PCR检测］［PCR反应特点］［PCR的循环参数］[PCR仪器]PCR实验室的建立方法[编辑本段][概述]DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenowfragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaqua ticus）分离出来的。
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶在适当温度下的体外酶促反应，在较短时间内大量复制目标DNA片段，并使其扩增至可检测水平。
PCR包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤使DNA双链解开成两股单链，退火步骤使引物与目标DNA特异性结合，延伸步骤利用DNA聚合酶在合适温度下合成新DNA链。
这三个步骤连续循环进行，每一轮都会产生双倍数量的目标DNA。
PCR具有高度特异性、高灵敏性和高速度的特点，可以从少量的起始DNA样品中扩增出目标DNA片段，常用于分子生物学研究中的DNA定量、基因检测、基因测序、基因工程等多个领域。
第五章 聚合酶链式反应
引物设计缺陷而引起的后果
生命科学学院
第三节 PCR引物设计原则
1.引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过 Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产 物的特异性 2.引物扩增跨度：以500bp为宜
特定条件下可扩增长至10kb的片段
生命科学学院
第五章 聚合酶链式反应
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现， 1987 获专利。 1986，PE-Cetus公司发现并纯化出适用于PCR的耐热DNA聚合 酶 1987，PE-Cetus公司推出PCR自动化热循环仪 1988，PE-Cetus公司获得基因工程方法生产的耐热DNA聚合酶 1989，PE-Cetus公司获得PCR方法、天然Taq酶及重组Taq酶 三项专利 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之 首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
生命科学学院
第二节 PCR体系
二、PCR反应的成份
3. dNTPs
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.02 ～ 0.2 mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓 度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。
过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。
3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带
名词解释pcr
名词解释pcr
《PCR：真相与谣言》
PCR，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种用于扩增DNA片段的技术。
它是在20世纪80年代由美国生物化学家凯瑟琳·穆尔和美国生物学家基利斯·思蒂利发明的。
PCR技术的原理是通过不断地重复一系列的加热和冷却步骤，让DNA模板的两条链分离，然
后通过DNA聚合酶复制出两条新的DNA链，从而实现对DNA片段的快速扩增。
这种技术可
以从极少量的DNA样本中扩增出大量的目标DNA片段，因此在生物学和医学领域具有广泛
的应用。
PCR技术被广泛应用于医学诊断、法医学、基因工程等领域。
在医学诊断中，PCR技术可以
用于检测感染病毒或细菌的DNA片段，帮助医生进行快速而准确的诊断。
在法医学领域，PCR技术可以用于对犯罪嫌疑人的DNA进行鉴定，从而帮助解决案件。
在基因工程领域，PCR技术可以用于克隆基因或进行基因突变分析。
然而，尽管PCR技术在许多领域都有着重要的应用，但也存在着许多关于PCR的谣言和误解。
有人认为PCR技术不可靠，容易出现假阳性和假阴性结果；还有人认为PCR技术可以用于克
隆人类；甚至还有人认为PCR技术可以用于改变个体的基因。
这些都是与事实不符的谣言。
因此，了解PCR技术的原理和应用，以及识别和纠正PCR技术的谣言和误解，对于提升公众
的科学素养和推动科技的发展具有重要意义。
pcr原理
pcr原理PCR全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种基于DNA复制的技术，可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR的原理是通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA扩增的过程，最终得到大量目标DNA。
PCR技术广泛应用于生物医学研究、医学诊断和法医学等领域。
PCR的核心原理是复制DNA。
它主要由三个步骤组成：变性、引物结合和DNA扩增。
首先是变性步骤。
在这一步骤中，DNA在高温下被加热至95℃左右，使DNA的双链结构解开，变成单链结构。
这个步骤中需要一台PCR热循环仪来提供高温环境。
接下来是引物结合步骤。
在这一步骤中，引物与目标DNA 进行配对结合。
引物是一段短的DNA片段，其中包含与目标DNA互补的序列。
引物的设计是PCR中非常重要的一步，合适的引物能够提高PCR的扩增效率。
引物结合的温度通常在50-65℃之间，可以使用PCR热循环仪进行控制。
最后是DNA扩增步骤。
在这一步骤中，DNA聚合酶将引物和目标DNA之间的空隙补全，并合成新的DNA链。
DNA聚合酶是一种能够在适宜温度下催化DNA合成的酶。
此步骤需要一个适宜的温度和特定的时间。
一般情况下，温度在50-75℃之间，时间在几十秒到几分钟之间。
PCR热循环仪能够提供准确的温度控制和时间控制。
以上三个步骤构成了PCR反应的基本循环。
每个循环都会使DNA扩增一倍，经过多个循环，原始DNA可以得到大量扩增。
PCR反应的循环次数通常为20-40次，根据需要可以进行调整。
PCR技术的应用非常广泛。
例如，在医学诊断中，PCR可以通过扩增目标病原体的DNA来检测疾病。
在基因工程中，PCR可以用来扩增具有特定功能的DNA片段，然后进行进一步的研究。
在法医学中，PCR可以用来进行DNA鉴定，例如刑事案件的嫌疑人或受害者的识别。
总之，PCR技术通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA扩增的过程，可以在短时间内扩增DNA片段。
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引物设计基本原则
• 引物的3’端尤其要避免重复的CG碱基序 列
• 二条引物的Tm值不能差别太大 ℃ Tm=2（A+T）+4（C+G）
• 合成引物时在其5’端可以加修饰成份 • 设计引物最好用电脑软件进行分析
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脱氧核苷三磷酸（dNTP）
• 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物
PCR反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。
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延伸温度与时间
延伸温度设为72℃， 因为Taq DNA聚合 酶在72℃时具较高的酶促活性，有利于DNA 的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过 长易导致非特异性扩增。
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变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前 提。在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组DNA充分变 性。一般在940C变性5～10 min。进入循环反 应后以94℃变性30～40s, 足以使模板DNA双 链变性。
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退火温度和时间
绝对定量 PCR
1. 外参照系统的设置 2. 内参照系统的设置
▪ 实时定量 PCR
对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析
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TaqManTM
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs
Thermal Stable
DNA Polymerase
R 5’
Probe
Q 3’
第二个循环
5’ 3’
4个拷贝
3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’
3’ 5’
第三个循环
3’
5’ 3’
8个拷贝
5’ 3’
5’ 3’
3’
第n个循环 2n个拷贝
PCR的反应体系
参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。
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PCR的反应条件
• 反应温度（变性、退火、延伸） • 反应时间（变性、退火、延伸） • 循环次数（PCR效率及产物量）
耐热DNA聚合酶
添加反应混合液 及样本
加入试管中
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退火
变性
PCR原理
3’ 5’
3’
Taq
5’
Taq
3’
Taq
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循环
5’ 3’
延伸
5’ 3’
Taq5’
3’
继续延伸
PCR原理
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
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5’ 3’
5’ 3’
10×
2.5 1×
25 mmol/L 2.5 2.5mmol/L
25 mmol/L 0.2 200mmol/L
1U/ml
1.0 0.04U/ml
100ng/ml
1.0 4.0ng/ml
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其它反应因素
• pH应保持在酶反应所需的最适pH • 盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性
及聚合酶的活性） • 二甲亚砜（DMSO）能破坏模板的二级结构 • 牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶
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引物设计基本原则
• PCR反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补
• 引物的长度一般以18~25个核苷酸为宜 • 二条引物之间（尤其在3’端）的序列不
可有互补，以免形成引物二聚体 • 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤
、 嘧啶碱基堆积
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配制PCR反应体系（例）
PCR反应体系(25ml) 去离子水 正向引物 反向引物 10×PCR反应缓冲液 镁离子 dNTP Taq DNA聚合酶 模板DNA
试剂浓度 体积(ml) 终浓度
15.8
10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L
10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L
的活性
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循环次数
• 重复次数一般设为25～35个循环 • 35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消
耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随 循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平 台期
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PCR过程的实时监测
指数增长期 线形增长期 平台期
理论值
实际值
Log 产物DNA
聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction
PCR技术
• 由美国Cetus公司K.Mullis 于1983年建立 • 能在体外复制已知序列的DNA片段 • 具有扩增效率高和特异性强的特点 • 为生命科学领域的研究开创了崭新时代
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PCR原理
3’
5’
5’
3’
引物
d.NTPs
• 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 • 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异
性扩增也随之增加
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DNA聚合酶
• 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性
• Taq 酶的作用: 催化DNA合成。即在模板指导下，以dNTP 为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核 苷 酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链 沿
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循环数 #
Log 产物DNA
相对定量PCR
理论值 实际值
设计相对定量PCR实验方案时须注意： • 预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所
采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者
分离开。 2021/3/3
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模 板 (template)
• 模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 等）
• 模板DNA须有较高的纯度 • 模板加入量影响PCR效率和产物的特异性
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引 物（Primers)
• 化学合成的寡核苷酸 • 能与模板特异地结合 • 引物决定产物的特异性和长度 • 引物设计时必须遵循一些原则
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镁离子浓度
• 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性十 分重要
• 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。
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