组织化学法
组织化学方法
+采集发育中后期及成熟种子并用FAA 固定保存。
用滑走切片机冰冻切片法制片，爱尔新蓝一番红染色，甘油胶封藏。
具体组织化学方法：（1）用氯化汞一溴酚蓝鉴定蛋白质。
（2）高碘酸一锡夫试剂鉴定多糖。
（3）碘一碘化钾鉴定淀粉。
（4）苏丹黑B鉴定脂类物质。
（5）PAS法进行可溶性糖鉴定。
（6）含浓硫酸或高氯酸的显色剂能使人参皂甙产生从淡红到紫红的系列颜色反应=颜色的深浅与人参皂甙的含量成正相关![绞股蓝龙须茶的人参皂甙组织定位及皂甙含量的季节变化8-10]（7）组织化学方法冰冻切片法P将干燥的龙须茶在40温水中浸泡0.5小时，取顶芽下第2`3节的茎和叶投入醋酸铅饱和水溶液中处理24小时，Leicac-CM1850冷冻切片机冰冻切片,厚度30um。
组织化学定位：以等量的5％香草醛－冰醋酸和高氯酸混合试剂对冰冻切片显色，临时装片。
Leica－DMLB显微镜观察照相。
(8)组织化学分析结果表明，其分泌细胞团经5％NaOH水溶液处理，由黑色或红色变成绿色，而分泌囊则未变色；分泌囊经苏丹黑染色，变成灰黑色，而分泌细胞团不变色，说明分泌细胞团含金丝桃素类物质，而分泌囊则含挥发油。
Some methods of foreign papers as follows.（1）The various plant materials were treated with Toluidin Blue as a general purpose stain (O'Brien and McCully,1981), and with the following histochemical stains : 各种植物用Toluidin Blue 作为一个总体的染色,具体的组化反应见以下:（2）lipids, Alkanna tincture (Faure, 1914); 安娜酊剂鉴定脂类.（3）pectic substances果胶物质, Ruthenium Red (Jensen, 1962)钌红鉴定果胶类物质; essential oils, Sudan III with glacial acetic acid as control (Johansen, 1940); 冰醋酸的Sudan三溶液作为一个控制鉴定挥发油.（4）alkaloids, Wagner reagent (Furr and Mahlberg, 1981), Dragendorff reagent (Yoder and Mahlberg, 1976), 1% picricacid(Faure, 1914), Phosphomolybdic acid (Faure, 1914) and Iodine-potassium iodide solution (Lugol: Johansen, 1940).All histochemical stains were matched by controls.（5）Toluidine Blue (O'Brien and McCully,1981) as a generic dye for DNA, cytoplasm and some components of the cell wall; 甲苯氨蓝作为一般的染料鉴定DNA,细胞质和一些细胞壁的成分.（6）PAS (O'Brien and McCully,1981) for non-cellulosic polysaccharides.PAS反应鉴定非纤维素多糖.（7）Alkanna tincture(Faure, 1914) and Nile blue (Cain, 1947) for total lipids;安娜酊剂和尼罗兰鉴定总的脂类或油脂.（8）Sudan III with glacial acetic acid as a control (Johansen,1940) and Nadi reagent (David and Carde, 1964) for essential oils;冰醋酸的苏丹三作为控制,Nadi reagent鉴定挥发油.（9）Nadi reagent (David and Carde, 1964) for resins;（10）Wagner and Dittmar reagents (Furr and Mahlberg,1981) and iodine iodide solution (Lugol) (Johansen, 1940) for alkaloids;（11）potassium bichromate (Faure, 1914) for tannins; 重铬酸钾鉴定丹宁.（12）Dela®eld hematoxylin (Faure, 1914) and Ruthe-nium Red (Jensen, 1962) for pectic-like substances类似果胶的物质;（13）anti-mony trichloride (Hardman and Sofowora, 1972) for steroids; 三氯化锑鉴定类固醇,(14)brilliant blue Coomassie R250 (Fisher, 1968) for proteins; 库码西R250亮兰鉴定蛋白质.（15）concentrated sulfuric acid (Geissmann and Gri n, 1971) for sesquiterpene lactones.浓硫酸鉴定蓓半萜内酯.（16）分根、根茎、茎、叶四部分进行冰冻切片；于横切面上滴加新配制的99 乙醇一硫酸混合液(1：1)在显色反应l0～30rain之间，以显微镜观察颜色变化。
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
sabc免疫组化法
sabc免疫组化法SABC免疫组织化学法（Streptavidin-Biotin Complex Immunohistochemistry）是一种常用的免疫组织化学技术，于1980年由Hsu等人首次提出，其基本原理是利用亲合素-生物素结合系统来增强免疫反应的信号和灵敏性。
该技术广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域，用于检测和定位各种细胞和组织中的抗原或分子标记物，具有高灵敏度和高特异性的特点。
SABC免疫组织化学法的基本步骤如下：1. 样本固定：将待检测的细胞或组织固定在载玻片上。
常用的固定方法包括冰乙酸法、乙醇法和甲醛法等。
2. 抗原修复：由于组织样本在固定过程中可能导致抗原受损或掩盖，所以需要进行抗原修复。
抗原修复的方法有热处理、酶消化和酸碱处理等。
3. 阻断非特异性结合：添加合适的蛋白质阻断液，防止非特异性结合。
4. 一抗孵育：将第一抗体孵育在样本上，第一抗体可以是多种来源，如小鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体等，与目标抗原结合。
5. 二抗孵育：将牛、羊或马等动物来源的生物素化的二抗孵育在样本上，二抗的特异性是由于其与人样本中免疫球蛋白的Fc区域结合而实现。
6. ABC复合物孵育：加入经过某种方式标记的ABC复合物，ABC复合物是指由Streptavidin（链霉亲和素A）和生物素化的过氧化物酶（HRP）构成的复合物，通过亲合素与生物素之间的高亲和力实现复合。
7. 标色显色：通过添加染色剂(如DAB)和过氧化氢等试剂，使得过氧化物酶催化反应产生沉积的有色产物。
8. 反应停止：用蒸馏水冲洗玻片，停止显色反应。
9. 后处理及封片：将玻片脱水，用透明剂固定标本，然后盖上封片剂，最后用显微镜观察和分析结果。
SABC免疫组织化学法的优点是具有高灵敏度和高特异性，对于目标抗原的检测和定位有较好的效果。
通过使用链霉亲和素A和生物素结合系统，可以增强免疫反应的信号，提高检测和定位的灵敏性。
此外，该方法简单易行，结果易于解释和分析，广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域。
免疫组织化学技术的原理及方法
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
现代组织化学组织化学
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
GUS组织化学染色方法
GUS基因组织化学染色
将共培养后的材料从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，切至0.2cm大小，放入离心管中，加入Buffer A至没过愈伤组织，置于37℃环境中，侵泡1 h。
用移液枪将Buffer A 吸出，加入Buffer B至没过愈伤组织，置于37℃黑暗环境中染色，至材料出现蓝色。
若叶绿素影响观察，可用75%乙醇漂洗材料，做脱色处理。
最后用蒸馏水将材料洗净，观察统计染色数。
Buffer A成分如下：
0.2 M NaPO4 buffer （PH 7.0）25 ml
蒸馏水23.75 ml
0.1 M K3[Fe(CN)6] 0.25 ml
0.5 M Na2EDTA 1 ml
Total 50 ml
其中0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由0.2 M Na2HPO4和0.2 M NaH2PO4配制而成。
每100ml的0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由62 ml 0.2 M Na2HPO4和38 ml 0.2 M NaH2PO4混合而成。
Buffer A置于4℃保存。
Buffer B由Buffer A和X-gluc 1：1混合配制而成。
Buffer B置于-20℃，避光保存。
组织化学技术教程
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结
免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结免疫组织化学是一种用于检测细胞或组织中特定抗原或抗体的技术手段。
其主要应用于病理学诊断、生物医学研究和临床治疗等领域。
在免疫组织化学中，直接法和间接法是两种常用的技术路线，在具体应用时各自具有一些优点和缺点。
本文将针对这两种方法进行系统总结，以期为免疫组织化学技术的选择提供一定的参考依据。
一、直接法直接法是指在组织切片上直接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：1. 杀菌、固定和脱水处理2. 抗原修复3. 封闭剂处理4. 抗体标记5. 染色显示直接法的主要优点包括：1. 操作简便，节省时间2. 对目标抗原或抗体的确认准确性高3. 信号直接来源于目标物质，信号强度相对稳定直接法的缺点包括：1. 信号叠加或掩盖现象相对较多2. 容易产生假阳性或假阴性结果3. 针对不同抗体需要反复优化条件二、间接法间接法是指在组织切片上间接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：1. 杀菌、固定和脱水处理2. 抗原修复3. 封闭剂处理4. 一抗处理5. 二抗标记6. 染色显示间接法的主要优点包括：1. 信号放大效应明显，检测灵敏度高2. 信号叠加或掩盖现象相对较少3. 可以使用多种不同抗体进行多重染色间接法的缺点包括：1. 操作相对复杂，耗时较长2. 对目标抗原或抗体的确认准确性略低3. 信号来源于间接标记物质，信号强度相对不稳定三、综合比较在实际应用中，直接法和间接法各自有其适用的范围。
直接法适用于对抗原或抗体的确定性检测需求较高的情况，例如对细胞表面抗原的检测；而间接法适用于对抗原或抗体的放大检测需求较高的情况，例如对低表达抗原的检测。
在选择具体方法时，应根据实际实验目的和样本特点来进行综合考量，以确保获得可靠和准确的实验结果。
免疫组织化学直接法和间接法各有其优缺点，科学家在具体选择使用时应结合实验目的，灵活运用，以达到最佳的实验效果和结果。
希望本文能为相关科研工作提供一定的参考价值。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学常用方法大全.pdf
● HRP/POD（辣根过氧化物酶）
显色原理：
HRP + H2O2 体）
HRP ·H2O2 + 供氢体 （电子供
型）
HRP + H2O + 供氢体 （氧化
DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色
● ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT
6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min × 3次 8. 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 9. 观察、记录
second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP
ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10μg/ml biotin 2.5μg/ml 临用前30分钟配制
一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ）
生物素标记的第二抗体与链霉菌 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。
操作步骤： ● 石蜡切片，脱蜡至水； ● 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过
氧化酶的活性； ● 第一抗体； ● 生物素标记的第二抗体； ● 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； ● 显色、复染、封片、观察。
基本原理与操作步骤
第一节 免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。
96～98℃抗原 免疫组织化学法
96～98℃抗原免疫组织化学法概述96～98℃抗原免疫组织化学法是一种重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
它通过特定的抗原抗体反应，能够有效地检测和定位目标蛋白在组织中的表达情况，具有较高的灵敏度和特异性。
本文将从浅入深地探讨96～98℃抗原免疫组织化学法的原理、应用、优势和局限性，并结合个人观点展开讨论。
一、原理96～98℃抗原免疫组织化学法是基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在实验过程中，组织标本经过预处理后，与目标抗原特异性抗体结合，形成免疫复合物。
随后，通过96～98℃的高温处理，使组织蛋白发生变性，同时保持抗原与抗体的结合，从而增强稳定性和可溶性，最终通过染色和显微镜观察，实现对目标蛋白的定位和分析。
二、应用96～98℃抗原免疫组织化学法在病理学研究、癌症诊断、免疫学实验等领域有着广泛的应用。
通过该技术，可以有效地检测和分析组织中蛋白及细胞的位置、数量和分布情况，为疾病诊断和治疗提供重要依据。
该方法还可用于研究免疫组化与疾病发生发展的关系，为新药研发及临床转化研究提供有力支持。
三、优势与局限性96～98℃抗原免疫组织化学法具有灵敏度高、特异性强、定位准确等优势，能够满足对于组织特定蛋白表达情况的准确检测需求。
然而，该方法在操作技术上较为繁琐，且对实验条件要求严格，容易受到环境因素和标本质量的影响，存在耗时长和易产生假阳性等局限性。
四、个人观点以我个人的理解，96～98℃抗原免疫组织化学法作为一种重要的实验技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景和发展空间。
尽管存在着一些局限性，但随着科学技术的不断进步和实验方法的改进，相信这一方法将会更加成熟和完善，为科研工作者和临床医生提供更准确、有效的实验手段，推动生物医学领域的发展。
总结96～98℃抗原免疫组织化学法作为一种重要的实验技术，在病理学、癌症诊断、免疫学等领域有着广泛的应用。
它以其特异性、灵敏度高、定位准确的特点，为生物医学研究和临床诊断带来了便利。
general histochemical methods -回复
general histochemical methods -回复一、什么是组织化学方法？组织化学方法是一种在组织切片中使用特定的化学方法和染色剂来鉴定和定位特定分子和结构的技术。
它在解剖学、生理学和病理学研究中起着至关重要的作用。
组织化学方法通常用于识别细胞或组织中的特定细胞类型、细胞器、细胞分子或化学分子。
不同的染色剂和化学试剂可以通过特定的分析方法来标记特定的分子或结构，并通过显色或荧光观察来识别它们的位置。
二、组织化学方法的主要类型有哪些？1. 免疫组织化学方法：免疫组织化学方法通过使用特定的抗体来鉴定组织切片中特定的蛋白质、多肽、抗原或细胞表面标记物。
这些抗体可以与待分析物质结合，并通过染色剂或荧光标记来显示其位置。
免疫组织化学方法在研究细胞分型、疾病诊断和治疗监测等方面具有重要作用。
2. 酶组织化学方法：酶组织化学方法通过使用特定的酶和染色剂或底物来标记和显示特定分子的位置。
常见的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），它们可以与酶底物反应生成可见的色素。
酶组织化学方法常用于检测酶的分布和定位。
3. 特殊染色方法：特殊染色方法使用特定化学试剂来染色特定组织结构或分子。
这些方法可以通过染料的亲和性选择性地染色特定的结构或分子。
常见的特殊染色方法包括Heidenhain铁染色、Mallory染色和Prussian 蓝染色等。
4. 组织学酶化学方法：组织学酶化学方法通过观察组织中特定酶的活性来评估生物代谢。
通过在组织切片中使用特定的底物和染色剂，可以观察到酶活性的产生和局部化，从而了解细胞和组织的功能状态。
5. 其他方法：除了上述主要类型外，还有许多其他的组织化学方法，如细胞肥大染色、细胞运动染色和细胞分裂染色等，这些方法可以根据具体研究需求进行选择和应用。
三、组织化学方法的步骤是什么？组织化学方法通常包括以下步骤：1. 组织固定：将待研究的组织切片固定在载玻片上，以保持组织结构的完整性和稳定性。
02组织化学
二、组织化学特点及研究对象
组织化学使用的是已知的化学反应，是在组织或 细胞结构的原位上通过呈色反应或阳性反应（positive rection)显示该结构的化学成分和代谢状态。呈色反应 的强弱，表示该组织或细胞内化学物质含量的多少。 显示的化学成分类型主要有蛋白质、核酸、糖类、 脂类、无机成分及各种酶类。
（三）检测酪氨酸的Millon试验 检测酪氨酸的 试验
• 酪氨酸存在于除胶原蛋白以外的大部分蛋白质中，因此适 酪氨酸存在于除胶原蛋白以外的大部分蛋白质中， 于作一般蛋白质的标志反应。其化学反应包括两步骤： 于作一般蛋白质的标志反应。其化学反应包括两步骤： 1. 酪氨酸酚羟基的邻位或间位上的 被NO基取代，产生 酪氨酸酚羟基的邻位或间位上的H被 基取代 基取代， 了一种亚硝基酚； 了一种亚硝基酚； 2. 由于螯合作用，Hg被并入了亚硝基氮原子的新环中， 由于螯合作用， 被并入了亚硝基氮原子的新环中 被并入了亚硝基氮原子的新环中， 形成新的络合物呈红色的颜色反应。 形成新的络合物呈红色的颜色反应。
Schiff氏反应
Schiff试剂配制原理 试剂配制原理
4.甲月替反应法（氧化还原反应）： 甲月替反应法（氧化还原反应）： 甲月替反应法 甲月替是一种染料（ 甲月替是一种染料（NBT)，其中的四唑盐若接受 +将被还 ，其中的四唑盐若接受H 原成有色沉淀。凡是可产生 的反应都可用此方法显示。 原成有色沉淀。凡是可产生H+的反应都可用此方法显示。如 脱氢酶,根据氧化还原反应原理，在酶的作用下使底物氧化， 脱氢酶 根据氧化还原反应原理，在酶的作用下使底物氧化， 根据氧化还原反应原理 氢离子为四唑盐接受而还原为深色不溶的染色沉淀。 氢离子为四唑盐接受而还原为深色不溶的染色沉淀。 5.联苯胺反应法（DAB法）： 联苯胺反应法（ 联苯胺反应法 法 显示过氧化酶的方法。过氧化酶分解 产生新生氧， 显示过氧化酶的方法。过氧化酶分解H2O2产生新生氧，后 者在将无色联苯胺（二氨基联苯胺）氧化成联苯胺蓝（ 者在将无色联苯胺（二氨基联苯胺）氧化成联苯胺蓝（不稳 定），进而变成棕色化合物。 ），进而变成棕色化合物。 进而变成棕色化合物
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免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合， 免疫组织化学相关图书
制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的
编辑本段相关操作
仪器设备
1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅
试剂
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
抗体稀释液的配制 牛血清白蛋白：2mg
叠氮钠： 10～20ml
双蒸水： 10ml
7 PBS冲洗三次，每次5分钟。
8 滴加二步法EnVision TM孵育30分钟。
9 PBS冲洗三次，每次5分钟。
10 甩去PBS液，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色。一般显色时间为5分钟左右，终止反应，自来水充分冲洗。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本
石蜡切片的抗原修复及方法
常用染色方法
抗体反应 交叉反应原因
多抗和单抗特性比较
抗体保存
展开 编辑本段简介
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
4 PBS冲洗三次，每次5分钟。
5 滴加4 %羊血清封闭，室温30分钟，以减少非特异性染色。
PBS10 ml+正常羊血清400 ul
6 甩去羊血清，根据不同的项目配制并滴加不同的一抗，浓缩型的抗体一定要在购买后先用已知的阳性片做梯度实验，根据结果情况找出最佳稀释浓度再用到临床诊断。工作液也应该在购买后先用已知的阳性片检测抗体的染色效果，直接滴加即可。每次还应带上阳性对照和阴性对照，以保证结果的可靠性。每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，防止切片干燥影响结果，室温孵育2小时。
一般的sp法步骤啊,具体如下：
1.烤片，68℃，20分钟,
2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min
3.阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;
7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;
8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，
苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
SP(sidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.
按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.
6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；
操作流程
1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化； 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复； 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 15）PBS或自来水冲洗10分钟； 16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 17）自来水冲洗10～15分钟； 18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 4)抗原修复。 5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 8)PBS洗三次每次2分钟。 9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 10)PBS洗3次每次2分钟。 11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 12)PBS洗4次每次5分钟。 13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。
柠檬酸缓冲液的配制（PH6.0）
0.1M柠檬酸：（4.2g+200ml蒸馏水）
0.1M柠檬酸三钠 （14.7g+500ml蒸馏水）
取柠檬酸三钠41ml+柠檬酸9ml加入450ml蒸馏水中，总量为500ml即可。
3 配制3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，孵育十分钟。
PBS90 ml+30 %过氧化氢10 ml，现用现配并摇匀，盖上盖子，防止见氧分解挥发。
编辑本段常见问题
免疫组化实验所用的抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本
11 苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，氨水返兰或自来水返兰（自来水返兰时间要稍长些，应该在显微镜下看以下苏木素复染情况），自来水冲洗。
12 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，阅片并总结染色结果。
免疫组织化学百科名片
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。