谷胱甘肽含量测定
谷胱甘肽的制备及含量测定
• 3.谷胱甘肽的主要来源 • 谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重 要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很 高，达100～1000mg/100g,在人体血液中含26～ 34mg/100g，鸡血中含58～73mg/100g，猪血中含10～ 15mg/100g,在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高(12～ 33mg/100g)，而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较 低(0.06～0.7mg/100g)。
谷胱甘肽的制备及含量测定
一、谷胱甘肽的背景知识
• 1.谷胱甘肽是一种什么 样的物质 谷胱甘肽(glutathiose,rglutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一种 含γ-酰胺键和巯基的三 肽，由谷氨酸、半胱 氨酸及甘氨酸组成。 谷胱甘肽：还原型谷胱 甘肽、阿拓莫兰、古 拉定
提取工艺
1、取5g干酵母，与15ml蒸馏水充分混合后倒入25ml沸腾的水中。 2、用5ml水洗涤烧杯一并倒入，使混合液保持在95-100℃，沸腾5min。 放置冰水中速冷。 3、在2000rpm速度下离心10min，取上清液，即谷胱甘肽抽提液。 4、谷胱甘肽抽提液，调pH至3.0。 5、上处理好的732阳离子交换吸附柱吸附。 6、用0.25mol/L的NaOH溶液洗脱，洗脱流速10ml/min。收集洗脱液， 洗脱终点用亚硝基氰化钠检测。 7、中和洗脱液至pH6.5。
•
谷胱甘肽还可以保护血红蛋白不受过氧化氢、自由基 等氧化从而使它持续正常发挥运输氧的能力。还原型谷胱 甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型 谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。 • 谷胱甘肽保护酶分子中-SH基，有利于酶活性的发挥， 并且能恢复已被破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶 重新恢复活性。 • 谷胱甘肽还可以抑制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。 • 谷胱甘肽对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减 少等症状，有强有力的保护作用。谷胱甘肽能与进入人体 的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进 其排出体外，起到中和解毒作用 。
谷胱甘肽(GSH)含量测定
谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
食用菌中谷胱甘肽的测定
食用菌中谷胱甘肽的测定谷胱甘肽是一种重要的抗氧化物质，被广泛应用于食品工业中。
食用菌是一类含有高丰富谷胱甘肽的食材，因此测定食用菌中谷胱甘肽的含量具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的测定食用菌中谷胱甘肽的方法。
一、硫巴比妥酸法测定谷胱甘肽含量硫巴比妥酸法是目前测定谷胱甘肽含量最常用的方法之一。
该方法的原理是谷胱甘肽与硫巴比妥酸在碱性条件下反应生成黄色产物，通过测定产物的吸光度可以间接测定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品粉碎并称取适量，加入酸性溶液中，破坏细胞结构释放出谷胱甘肽。
2. 加入碱性溶液和硫巴比妥酸，使谷胱甘肽与硫巴比妥酸反应生成黄色产物。
3. 使用分光光度计测定产物的吸光度，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
二、高效液相色谱法测定谷胱甘肽含量高效液相色谱法是一种常用的分离和定量化合物的方法。
该方法的原理是利用色谱柱对样品中的谷胱甘肽进行分离，通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高来定量谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，经过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 使用高效液相色谱仪，将待测样品注入进样器，经过一定的流动相条件下，在色谱柱中进行分离。
3. 通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
三、氧化还原法测定谷胱甘肽含量氧化还原法是一种直接测定谷胱甘肽含量的方法。
该方法的原理是利用谷胱甘肽与还原剂在适宜的条件下发生氧化还原反应，通过测定反应前后还原剂的含量变化来确定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，通过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 将待测样品与还原剂在适宜的条件下反应，使谷胱甘肽发生氧化还原反应。
3. 通过测定反应前后还原剂的含量变化，计算谷胱甘肽的含量。
在测定食用菌中谷胱甘肽的含量时，需要注意样品的制备过程，确保提取到的谷胱甘肽是代表样品中真实含量的。
同时，选择合适的测定方法，准确、快速地测定谷胱甘肽含量，有助于评估食用菌的品质和营养价值。
谷胱甘肽(GSH)含量测定
谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒说明书__ 可见分光光度法UPLC-MS-4486
还原型谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：UPLC-MS-4486规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体50mL×1瓶4℃保存试剂二液体50mL×1瓶4℃保存试剂三液体15mL×1瓶4℃保存标准品粉剂10mg×1支4℃保存溶液的配制：1、标准品：称1mg标准品用1mL蒸馏水溶解，浓度为1mg/mL。
产品说明：谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。
2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。
技术指标：最低检出限：2.67μg/mL线性范围：3.125-250μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织处理：新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。
加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1mL试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g，4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
2、血液处理血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一, 4℃，8000g离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
实验五植物组织中谷胱甘肽含量的测定
实验五植物组织中⾕胱⽢肽含量的测定⾕胱⽢肽含量的测定⼀、实验⽬的1、了解⾕胱⽢肽在植物抗逆中作⽤。
2、了解⽬前⾕胱⽢肽含量的测定⽅法。
3、掌握⽐⾊法测定植物体⾕胱⽢肽含量的原理与技术。
⼆、实验原理还原性⾕胱⽢肽(GSH)作为⽣物体内最主要的⾮蛋⽩巯基以及含量最丰富的低分⼦多肽，是植物细胞重要的抗氧化剂之⼀，在植物抗逆过程中直接或间接地参与了许多植物的功能活动，是⼀个良好的表⽰氧化胁迫的指标。
⾕胱⽢肽(GSH)是由⾕氨酸、半胱氨酸和⽢氨酸结合⽽成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。
在巯基化合物的存在下，⽆⾊的DTNB将被转变成黄⾊的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最⼤吸收，⽽且DTNB的吸收光谱并不造成⼲扰，所以可以⽤分光光度计进⾏测定。
即：GSH和TDBN在pH=7时⽣成黄⾊物质，其颜⾊深浅与GSH的浓度成线性关系。
三、实验材料、试剂与仪器1、实验材料：⼩麦叶⽚2、实验试剂：（1）GSH标准溶液〔0.01mg/ml GSH标准溶液（=亦即10µg/ml）〕：称取50mg 分析纯GSH，溶于蒸馏⽔中，并定容于100ml，即为0.5mg/ml 之标准母液，⽤稀释10倍（0.05mg/ml=亦即50µg/ml GSH）注：⽤时再稀释5倍即为10µg/ml；（2）5%偏磷酸；（3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；（4）TDNB试剂：称取39.6mg⼆硫代双-⼆硝基苯甲酸（TDNB），⽤0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；（5）1mol/L NaOH溶液。
3、实验仪器：V-1000D型可见分光光度计；离⼼机；离⼼管；刻度试管；研钵；吸⽔纸适量；移液管等。
四、⽅法与步骤1、标准曲线的制作取7⽀刻度试管，编号，按表加⼊试剂：试剂（ml）试管号1 2 3 4 5 6 7GSH标准溶液（10µg/ml）0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0补蒸馏⽔到2ml 2 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0磷酸缓冲液 4 4 4 4 4 4 4DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度（µg/2ml即每管含量）0 1 2 4 6 8 10将上述溶液混合均匀，在室温下显⾊5min。
抗坏血酸谷胱甘肽测定
还原型谷胱苷肽GSH2．试剂配制（1）1mM GSH标准液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。
(不要)（2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。
（3）6mM DTNB：称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。
（4）2mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。
（5）1mMGSSG标准液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。
(不要)实际配置0.1M PBS(pH 7.5): 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml; （实际配置50 ml）6mM DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际配置50 ml，实际用量0.1189g）2mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml, 实际用量18.1mg）(1U)GRⅢ: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量10ml）5％磺基水杨酸：3个处理*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配置10ml）(实际用量0.5g/10ml)0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置100 ml）乙醚（二乙醚）: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际配置1000 ml）PBS Buffer 0.5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置150 ml）2-乙烯吡啶: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际用量20 ml）乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际用量1000 ml）1．标线制作：配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0.5mL 0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mL GSH启动反应，测定650s的A412（OD412），绘制标准曲线。
谷胱甘肽测定实验报告
一、实验目的了解植物组织中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽（GSH）是一种具有抗氧化作用的天然三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。
在生物体内，谷胱甘肽具有多种生理功能，如保护细胞免受氧化损伤、参与药物和毒素的解毒过程等。
还原型谷胱甘肽含量的测定对于研究生物体内氧化还原平衡、疾病诊断和药物治疗具有重要意义。
本实验采用分光光度计法测定植物组织中还原型谷胱甘肽的含量。
该方法的原理是：在一定的pH条件下，还原型谷胱甘肽与5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长处有最大吸收峰。
通过测定该波长处的吸光度值，可以计算出还原型谷胱甘肽的含量。
三、实验材料与仪器1. 材料：小麦幼嫩叶片、5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器等。
四、实验方法与步骤1. 样品制备：取小麦幼嫩叶片，用无水乙醇研磨成匀浆，离心取上清液。
2. 标准曲线绘制：分别取6支干净的试管，按表1加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，以DTNB浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定：取6支干净的试管，按表2加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算还原型谷胱甘肽的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0048x-0.0031，相关系数R²=0.9967。
2. 样品测定：根据标准曲线计算小麦幼嫩叶片中还原型谷胱甘肽的含量为（X±SD）mg/g。
六、讨论1. 实验结果表明，小麦幼嫩叶片中含有一定量的还原型谷胱甘肽，其含量与样品制备方法和实验条件有关。
谷胱甘肽标准测定方法
谷胱甘肽标准测定方法
谷胱甘肽的测定方法主要有以下几种：
1. 埃尔曼（Ellman）法：这是最常用的谷胱甘肽测定方法，其原理是谷胱甘肽在DTNB（二硝基苯磺酸）的作用下，生成具有黄色的DTNB-SH，通过测定其吸光度来定量谷胱甘肽的含量。
2. 弗斯特（Foster）法：这种方法是通过测定谷胱甘肽在酸性环境下的还原能力，即测定其对2-硝基-5-苯甲酸的还原能力，通过测定其产物2-氨基-5-苯甲酸的吸光度来定量谷胱甘肽的含量。
3. 比色法：这种方法是通过测定谷胱甘肽在酸性环境下的还原能力，即测定其对2,4-二硝基苯酚的还原能力，通过测定其产物2,4-二氨基苯酚的吸光度来定量谷胱甘肽的含量。
4. 高效液相色谱法（HPLC）：这种方法是通过分离、定量样品中的谷胱甘肽，通过比较其峰面积与已知浓度的谷胱甘肽峰面积来定量谷胱甘肽的含量。
5. 荧光光谱法：这种方法是通过测量谷胱甘肽的荧光光谱，通过比较其荧光强度与已知浓度的谷胱甘肽荧光强度来定量谷胱甘肽的含量。
以上方法都有其优点和缺点，选择哪种方法主要取决
于实验的目的和条件。
谷胱甘肽含量实验报告结果
谷胱甘肽含量实验报告结果1. 实验目的本实验旨在测定不同样本中谷胱甘肽的含量，探究谷胱甘肽在不同条件下的生成和消耗情况。
2. 实验方法2.1 实验材料- 谷胱甘肽标准品- 待测样本- 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=6.8)- 10%三氯乙酸- 1%二硫苏糖- 75mmol/L硝酸钠- 50mmol/L亚硫酸钠2.2 实验步骤1. 取不同浓度的谷胱甘肽标准品，分别加入磷酸缓冲液。
2. 将标准品和待测样本加入10%三氯乙酸中，振荡离心。
3. 取上清液稀释一半，加入1%二硫苏糖，室温放置15分钟。
4. 加入75mmol/L硝酸钠，室温放置5分钟。
5. 加入1ml 50mmol/L亚硫酸钠。
6. 在紫外-可见分光光度计上读取吸光度，得到吸光度与浓度的标准曲线。
7. 测定待测样本的吸光度，并根据标准曲线计算谷胱甘肽的含量。
3. 实验结果3.1 谷胱甘肽标准曲线谷胱甘肽浓度（µmol/L）吸光度:: ::0 0.00010 0.25020 0.48030 0.72040 0.9603.2 待测样本的吸光度和含量计算结果样本编号吸光度谷胱甘肽浓度（µmol/L）:: :: ::1 0.380 15.22 0.630 25.23 0.285 11.44 0.520 20.85 0.740 29.64. 结果分析根据谷胱甘肽标准曲线，可以计算出待测样本中谷胱甘肽的含量。
根据实验结果可知，样本1中谷胱甘肽的含量为15.2µmol/L，样本2为25.2µmol/L，样本3为11.4µmol/L，样本4为20.8µmol/L，样本5为29.6µmol/L。
从结果可以看出，不同样本中谷胱甘肽含量有所差异。
这可能是因为样本来源的不同，谷胱甘肽生成和消耗速率的差异等原因导致的。
5. 实验总结本实验通过测定不同样本中谷胱甘肽的含量，初步了解了谷胱甘肽的生成和消耗情况。
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：GSH/GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一。
因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。
测定原理：利用2-VP法测GSSG含量。
自备仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体300μL×1支，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体30μL×1瓶，-20℃保存。
临用前加入0.6 mL试剂三稀释，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入40 mL试剂三溶解，现配现用。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）的蒸馏水混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作:1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。
3. 测定管：取1 mL EP管，加入100 μ L上清液，5μ L试剂二，盖紧后混匀，置于37℃水浴30min；依次加入100 μ L试剂四，10 μ L试剂五，700 μ L试剂六，迅速混匀后，立即测定30 s和150 s光吸收A1和A2，计算ΔA=A2-A1。
谷胱甘肽检测方法
谷胱甘肽定义描述L－r谷氨酰基－L－半胱氨酰基甘氨酸含量：按干燥品计算，98.0%-101.0%性状外观性状：白色或几乎白色结晶性粉末或无色的结晶。
溶解度：易溶于水，微溶于96%乙醇及二氯甲烷。
鉴别A 比旋度符合特定的光学旋转测定（见测定项）。
B 红外吸收光谱检测（2.2.24)对比：谷胱甘肽CRS.测定溶液S：取该品5.0g，蒸馏水R溶解并稀释至50ml。
溶液澄清度溶液S澄清（2.2.1），无色（2.2.2,Method II) 比旋度（2.2.7）－15.5～－17.5（干品物质）取该品1.0g，蒸馏水R溶解并稀释至25.0ml。
有关物质采用毛细管电泳法（2.2.47)溶液应临用前新鲜配制毛细管-材料：石英（未涂层）-尺寸：有效长度0.5m，总长：0.6m，内径75 μm温度：25℃电解质溶液：取无水磷酸二氢钠R1.50g，加水R230.0ml，用磷酸R调节PH值为1.80。
加水R稀释至150.0ml，检测PH值，如有必要，用磷酸R或氢氧化钠溶液R调节PH值。
检测：采用分光光度计在200 nm处检测新毛细管的预处理：在首次进样前在压力138Kpa下用0.1mol/L盐酸溶液前冲洗毛细管20min，138Kpa压力下用水R冲洗10分钟已达到全平衡状态，用电解质溶液在350kpa 条件下冲洗40min，在电压20kv条件下保持60min。
预处理的毛细管：138 kPa压力下，用电解质溶液冲洗毛细管40min；批间冲洗：138 kPa压力下，依次用水R冲洗毛细管1min，0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗2min；水R冲洗1min，0.1mol/L盐酸溶液冲洗3min，最后用电解质溶液冲洗10min；进样：3.45 kPa压力下维持5s；注入电解质溶液（空白溶液），对照溶液（b）、（c）和供试溶液a、b迁移：电压为20KV运行时间：45min相对迁移率：相对于内标物质（约14min）杂质A=约0.77杂质B=约1.04；杂质E=约1.2杂质C=约1.26；杂质D=约1.3系统适用性分辨率：内标物质产生的峰与对照溶液C中那个杂质B产生的峰之间最低为1.5，如有必要，使用稀氢氧化钠溶液上调PH值峰-谷比：最低位2.5.其中：HP=杂质D产生的基线峰以上的高度HV=对照溶液中谷胱甘肽产生的峰的分离曲线的最低点以上的高度如有必要采用磷酸下调PH。
谷胱甘肽
谷胱甘肽的制备及含量测定一、实验目的1.了解谷胱甘肽的理化性质，作用，制备工艺2.掌握谷胱甘肽的含量检测的方法二、实验原理谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。
在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，达100～1000mg/100g,在人体血液中含26～34mg/100g，鸡血中含58～73mg/100g，猪血中含10～15mg/100g,在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高(12～33mg/100g)，而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较低(0.06～0.7mg/100g)。
谷胱甘肽的含量测定本实验采用亚硝基铁氰化钠法。
其原理是：谷胱甘肽在氨水存在下，与亚硝基铁氰化钠发生巯基反应，生成红色化合物。
测定中加入硫酸铵可以增加颜色反应的强度。
三实验器材1 .器材：50ml量筒一个100ml烧杯一个1ml，5ml移液管各一支50ml容量瓶一个，100ml容量瓶一个732阳离子交换吸附柱紫外分光度计比色皿3个试管若干收集器，蠕动泵电磁炉冰块若干离心机离心管PH试纸2.试剂：干酵母5g 0.25mol/LNaOH(1g NaOH 配置成100ml) 亚硝基氰化钠50%H2SO4（25ml,) 硫酸铵粉末1g 亚硝基铁氰化钠，氨水（班上一起配，）四、实验步骤提取工艺1、取5g干酵母，与15ml蒸馏水充分混合后倒入25ml沸腾的水中。
2、用5ml水洗涤烧杯一并倒入，使混合液保持在95-100℃，沸腾5min。
放置冰水中速冷。
3、在2000rpm速度下离心10min，取上清液，即谷胱甘肽抽提液。
4、谷胱甘肽抽提液，调pH至3.0。
5、上处理好的732阳离子交换吸附柱吸附。
6、用0.25mol/L的NaOH溶液洗脱，洗脱流速10ml/min。
收集洗脱液，洗脱终点用亚硝基氰化钠检测。
7、中和洗脱液至pH6.5。
8、真空浓缩，干燥，得还原性谷胱甘肽粗品谷胱甘肽的含量测定1、在试管中加入1.0g硫酸铵粉末，以使体系中硫酸铵达到过饱和；1ml待测的谷胱甘肽溶液，3ml硫酸铵饱和溶液，摇匀。
【doc】几种谷胱甘肽的检测方法
几种谷胱甘肽的检测方法2007.3(总第146期)几种谷胱甘肽的检测方法陈俭梅周琳(1.山东师范大学生科院济南250014)(2.山东大学医学院济南250014)摘要测定谷胱甘肽含量的方法有多种,目前还没有一种既快速,稳定,特异,又十分灵敏,经济的测定方法.本文对谷胱甘肽的各种测定方法作一综述.关键词谷胱甘肽检测GSH存在于所有生物细胞中,而以酵母,谷物种子胚芽,人体和动物的心脏,肝脏,肾,红细胞和眼睛晶状体中含量较高.正常人体内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比例为100:1,全血中GSH的正常浓度约为371mg/dl,人体的肝脏和肾脏是GSH主要的合成,代谫}和排泄器官.谷胱甘肽的主要生物学功能是保护生物体内蛋白质的巯基进而维护蛋白质的正常生物活性,同时它又是多种酶的辅酶和辅基.GSH的重要生物学功能与谷胱甘肽的分子结构有密切关系,例如GSH分子中的巯基参与中和氧自由基,解毒等重要助能;所含的Y一谷氨酰胺键能维持分子的稳定性并必参与转运氨基酸;GSH中的甘氨酸和半胱氦酸残基参与胆酸的代谢等….近年来,随着对GSH的生理,乍化等_片面研究的深入,GSH在医学,食品,保健,防衰老等方面正引起人们日益广泛的注意.谷胱甘肽(GSH)用途广泛,用基因工程微生物生物合成方法是生产谷胱甘肽的主要方式.作为前之一?,胱氯酸的浓度较高,对谷胱甘肽的测定有干扰.已有几种方i=_去用于半胱氨酸存在时谷胱甘肽的测定:酶分析方法可测高达1000倍半胱氨酸存在时谷胱甘肽的含量,结果较准确,但需价格昂贵的辅酶Ⅱ和谷胱甘肽还原酶,并且后者活力变化严重影响测量结果;色谱法冗长费时;Jocelyn采用将样品仁硫酸中煮沸lh的方法,不太安全;Wronski方法效果较好,但需用对羟基汞苯甲酸和萤光黄;荧光法容易受干扰,误差较大;乙二醛酶法需要复杂的技术和殴备J.日前测定谷胱甘肽含量的方法有多种,如嗨循环法,比色法,荧光光度法,流式细胞仪法,滴定法,高效毛细管电泳法和近些年发展的高压液相色谱法等,这些方法备有其优点,但也都有不足,日前还没有一种既快速,稳定特异,又…t分敏,经济的测定方法,谷胱甘肽的测定方法有待进…步的发展和完善.下面埘日前常用的儿种主要的测定方法做?介绍,比较和评价.1酶循环法其测定原理为氧化一还原反应:GSH被DTNB(5,5一dithiobis一2一nitrobenzoicacid;5,5一二巯一2一硝基苯酸)氧化,生成GSSG和稳定的TNB(5一thio一2一nitrobenzoicacid;5一巯基一2一硝基苯酸); GSSG与GSSG还原酶及NADPH(还原型烟酰胺嘹嘿呤■核苷酸磷酸)反应,还原成GSH.在NADPH与GSSG还原酶维持GSt?l总最不变的条件下,GSH和DTNB反应生成TNB的速率与样本中总谷胱甘肽成比.TNB于412nm波长处有最大吸光度,可以通过分光光度计来测定总谷胱甘肽水平(GSH+GSSG)-31.酶法测定谷胱甘肽,样本的制备要迅速,为GSH很容易氧化而使其浓度降低.本法还可测定GSSG水平.酶循环法最初由Owen和Belcher提出,之后由Shandon9FocdFerrnerH童tion246…期)…一一一…………………一.～一……一业堕邑蹩+ Tietze和Griffith进行了改进.酶衢环法是一种灵敏,快速的方法,其最火优点是灵敏度高,可测定含量仪0.1mol/L的样品,【收率93%一j06%.Manju等认:为此方法灵敏度高,但特异性不高,这是由于DTNB可与许多含性巯基基团物质反应.但此法不足之处在于其测定的是谷恍甘肽总量(GSH+GSSG),不能分GSH和GSSG;另外样本的准备电比较严格,要求控制采血至测定时问『卣J隔在3min内,否则将影响测定,使实际应受到很大限制.MargaretA.Baker等将酶循环『去与微量滴定板技术相结合,设计了一种快速,敏感,简便的测定大数量生物样本的GSH,GSSG的方法.其最大优点是可时测定大量的样本.为I'提高灵敏度,TamaraMourad等寻酶循环法与生物发光检测技术相结合,测定GSSG,灵敏度达pm(10.)7k平.2比色法郭黎平等_60测定大豆提取液中谷胱肽的含量时,发现在铜(Ⅱ)一新铜试齐JJ一谷胱甘肽一乙醇体系中测定谷胱甘肽的含量,乙醇具有叫显的增敏作用.采用CuSO.溶液和新铜试剂混合液[Cu一新铜试剂(1:2.5,摩尔比)]作为显色剂,检测波长为456nm,枪测限为2.0ug/ml,线性范围为2.0~24ug/ml,【收牢为99.54%,RSD为0.76%.赵旭东等I}艮据甲醛同谷胱甘肽和常见含笳基物质反应速度的不,提出了在含有其它巯基物磺溶液中测定谷胱甘肽含量的方法,通过控制两个相同供试品和甲醛的不『亩J反应时间,测定两者在波长为412nm时的吸收度,根据两者不同的吸收度值得出谷胱汁肽的含量.线性范为0.19～0.95g/L,回收率为96.7%,方法的结果误差小于0.5%.该方法实验成本低,分析快速,简,适于测定生物合成反应液中谷胱廿肽的含量.3荧光法曹新志等I噪用邻苯l¨_:甲醛(o—phthaldialdehyde, OFt)作为络合剂,住磷酸缓冲液(pH8.0)中,应用荧光分光光度讣来测定黄瓜中恍肽的含量.检测限为0.1ug/ml,线性范为0.1~40ug/ml,回收率为99.73%,RSD为1.24%.Hissin等选用OPT作荧兜剂,采用偏磷酸一磷酸钠一EDTA缓冲溶液(pH8.0),用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷胱甘肽的含量,谷胱甘肽的检测限为0,05umol,线性范围为0.05～0.8umol,RSD为4%.张建莹等探讨了金属离子对还原型谷胱"肽(GSH)一邻苯二甲醛(OPA)体系荧光信号的影响,实验结果表明Zn对体系的荧光信号有增强作用,而且zn能够提高GSH—OPA体系的稳定性,据此建立了一种以Zn作为荧光增强剂,快速简便测定还原型谷胱甘肽的新方法.GSH在1.3×10～1.4×10mol/L的范围内其浓度与体系相对荧光强度有良好的线性关系,检出限为1.1×10mol/L.本实验方法比较适合生物样中还原型谷胱甘肽浓度的测定.4高效液相色谱法(HPLC)HPLC是近年测定复杂牛物样本中各种毓基物的最好￡法.HPLC过程足溶质住固定相和流动相之问由于分配系数,吸附能力,亲和力,分子大小不同,进行连续分离的过程.HPLC法优点是可以区分开GSH,GSSG及20多种含巯基氨基酸衍生物.其足是灵敏度高,样本中GSH含量不得低于50umol/L;且样本的前处理过程耗时,测定大样本时不方便,所用的桂特殊. ARodrigueuz—Ariza等州介绍丫一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法.该法应用一套双通道电化学测定仪,可同时测定GSH,GSSG,还可测定PSSG(蛋白结合谷恍}_f'肽),具有高灵敏度,高选择性,高效的优点.Chung—shiYang等介绍了一种将HPLC与微透析联机测定谷胱甘jj太. 此法缩短r分析测定时间,简化了样本的准备过程,并提供了连续的监测程敬君等采刚KCIi容液一HCI溶液一甲醇一EDTA为流动相,电化学检测器(工作电极为玻碳电极,参比电极为Ag/AgCI,l丁作电为0.9V),测定鼠脯徽透析液中咣甘肽的含,枪测限为10nmol/L,叫收率为87_3%,RSD为1.8%. Brent等用甲醇和乙酸钠溶液(pH7)作为流动相,列'苯■醛(Orthophthalaldehyde,OPA)和恍甘肽络合生成一种高荧光的元环衍生物,荧光检Snar@ongFoodFerrnentatio,,27山东食品发酵2007.3(总第146期)测器,检测限为0.1pmol,线性范围0.1-200pmol,谷胱甘肽的回收率为99.2%,RSD为1.2%.该方法线性范围较宽,而且稳定性较高,适于测定混合组分中谷胱甘肽含量…】.5高效毛细管电泳法(HPCE)HPCE有非常好的分离效果.Frassanito等】采用HPCE测定生物供试品中谷胱甘肽的含量,紫外/可见检测器检测限为0.2ug/ml,线性范围为0.2～100ug/ml,RSD为1%.1987年,有人对HPCE中的电化学检测技术作了改进,克服了紫外-可见吸收检测器所遇到的光程太短的问题.1993年, Thomas等在测定鼠脑组织中谷胱甘肽的含量时,在HPCE系统中采用了Hg修饰Au电极,以pH5.5, 10mmol/L的2.(N.吗啉).乙基磺酸作为缓冲液,在0.15V(VSAg/AgC1)的电势下,检出限为0.53fmol, RSD为2.1%.6流式细胞仪法应用染色剂标记GSH形成GSH的荧光化合,同时使染色剂尽量对其他巯基物产生最小影响,以便判断染色背景的程度及其线形关系,根据GSH含量与荧光强度的一定的比例关系,从而得到GSH的值.对GSH进行标记的最理想染色剂应具有很好的专一性,另外,要求能够进行定量分析测定.而这些染色剂的专一性是相对的,一个常见问题是它们还可标志细胞内的其他巯基物,尤其是蛋白巯基.Durand和Olive通过对流式细胞仪巯基染色探针的早期研究,表明monobromobimane对GSH具有合理的专一性.Treumer研究了0一phthaldialdehyde(0PT),表明OPT同时与GSH与蛋白巯基结合形成荧光化合物,RiCe介绍了monobromobimane,目前来讲,这是一个最专一的GSH探针.流式细胞仪的特点是在短时间内可获得大最数据,统计学意义明显,能进行多参数相关测定.7亚硝基铁氰化钠法GSH在NHOH存在下,与亚硝基铁氰化钠发生巯基反应,生成红色化合物.测定中加入硫酸铵可以增加颜色反应的强度.具体操作参照文献.谷胱甘肽在反应显色后,其生成的色泽很不稳定,50-60秒钟时其光密度即见减低.因此规定比色需在30秒内完成.谷胱甘肽含量达100mg/ 100ml时,一般其浓度与光密度仍符合比尔定律.半胱氨酸的存在会严重干扰GSH的测定,使测定值明显偏高.刘娟等¨对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下:在测定管中加入1.0g硫酸铵粉末(以使体系中硫酸铵达到过饱和),1m1分析样品,3mL硫酸铵饱和溶液,摇匀.DHo.5mL亚硝酸基铁氰化钠试剂,随UlJDH入0.7mL8mol/L的NHOH溶液,混合,立即用分光光度计在525nm进行比色,读取各管光密度.通过计算或从标准曲线上得出GSH浓度.8四氧嘧啶法GHS在实验条件下与四氧嘧啶作用的生成物在305nm有最高吸收峰,本法也称四氧嘧啶305 法.具体操作参照文献】.四氧嘧啶法中,反应显色后30min以内光密度未见降低,显色稳定.相对误差可以控制在2%以内,相对标准偏差可以控制在4%以内,说明这种方法的准确度和精密度较高,且半胱氨酸不干扰测定结果.刘娟等对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下:在测定管中加入1mL分析样品,1mL0.1mol/L的四氧嘧啶溶液,混合,加入0.5molpH值7.5磷酸盐缓冲液和0.1mol/LNaOH溶液各1 mL,随即混合.计时开始6min,加入1mol/LNaOH溶液,混合后,用紫外分光光度计在305nm测定光密度,读取各管读数.通过计算或从标准曲线上得出GSH浓度.鉴于文献¨中测定的是血液中GSH的浓度,因此采用四氧嘧啶法在测定前需用三氯乙酸或偏磷酸除去蛋白.测定酵母提取液中GSH的浓度,在提取GSH时采用温差破碎细胞,酵母中的蛋白可以以沉淀形式除去,离心后GSH提取液中已经不含有蛋白.因此可以省略原方法中三氯乙酸或偏磷酸除蛋白的过程,原测定步骤也相应简化.9DTNB法28——ShandongFoodFermentation2007.3(总第146期)山东食品发酵GSH和DTNB反应生成黄色的5一硫代一2硝基苯甲酸,在412nm波长有最大吸收峰.方法:样品1式2份,pH8.0条件下分别和甲醛反应2min和60min,各取lmL加入5mLDTNB溶液,25℃反应5min后分别测定在波长412nm的吸光度,算出2者的差值△A,代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量.得到谷胱甘肽浓度在0.19-0.95gL.之间线性关系良好,回归方程为:Y=0.7154X一0.0004,r=0.9999,最大误差不超过6%.本方法成本低廉,简单易行, 特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析.DTNB法中,反应显色后30min以内光密度未见降低,显色稳定.相对误差可以控制在2%以内,相对标准偏差可以控制在4%以内,说明这种方法的准确度和精密度较高,且半胱氨酸不干扰测定结果.刘娟等¨对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下:将分样品0.5mL加入1.5mL0.15mol/LNaOH溶液中, 摇匀,加入体积分数=0.03,甲醛0.5mL,摇匀,静置2min.加入2.5mLDTNB分析溶液,摇匀,在25℃水浴保温5min,测定在波长412nm处的吸光度A,通过计算或从标准曲线上得出相应GSH 浓度.DTNB法经改进后,其灵敏度比原先提高了三倍.另外,蓝金贵等报道了一种快速,简便和廉价的谷胱甘肽(GSH)含量测定的新方法.利用GSH的还原性将磷钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝, 在710nm最大吸收波长处测其吸光度,吸光度与GSH的浓度在3.3×10..一1.3×104mol/L范围内呈线性关系,相关系数r=O.9982,方法检测限为1.6×10..mol/L,相对标准偏差RSD=1.1% (n=6),回收率为97.1%一103.5%.该法应用于药品中GSH含量的直接测定,结果满意.综上所述,目前对于谷胱甘肽的测定还没建立一个既十分灵敏,特异,又十分快速,稳定,经济的方法.谷胱甘肽的各种测定方法各有其优点,有的灵敏度高,有的快速可靠,有的可区分开各种成分;同时也存在各自的不足,有的样本准备过程复杂,有的测定各成分分离不佳,有的需要昂贵设备.一个快速,稳定,特异,灵敏,经济的测定方法,有待进一步建立.参考文献[1]沈亚领,李爽等,谷胱甘肽的应用与生产,工业微生物,2000,30(2):4l一45[2]赵旭东,魏东芝,万群,等,谷胱甘肽的简便测定法[J].药物分析杂志,2000,20(1):34—37[3]AndersonME.Determinationofglutathioneandglu—tathionedisulfideinbiologicalsamples[J].Methodsin enzymology,1985,l13:548—555[4]MouradT,MinKL,SteghensJP.Measurementofoxi—dizedglutathionebyenzymaticrecyclingcoupledtO ioluminescentdetection[J].AnalyticalBiochenistry,2000, 283.:146—152[5]攀跃平,于健春等,谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价,中国临床营养杂志,2003,l1(2): 136—139【6]郭黎平,刘国良,张卓勇,等.铜(II)一新铜试剂一谷胱甘肽乙醇体系显色反应研究[J].光谱学与光谱分析, 2000,20(30):4l2-4l4.[7]曹新志,陈彦.荧光法测定黄瓜中的谷胱甘肽【Jl'资源开发与市场,2000,l6(5):272—273.【8】HissinPJ,HilfR.Afluorometricmethodfordetermina—tionofoxidizedandreducedglutathioneintissue【J】.Anal Biochem,1976,74:2l4—226.[9]张建莹,齐剑英等,锌离子增强荧光光谱法测定谷胱甘肽[J].暨南大学,2004,25(1):88—91[10]ArizaAR,ToribioF,BareaJL-Rapiddeterminationof glutathionestatusinfishLiverusinghigh??performanceliq??uidchromatographyandelectrochemicaldedection[J].Jour—nalofChromatographyB.1994.656:311—318【l】]杨培慧,齐剑英,冯德雄,蔡继业.谷胱甘肽的应用及其检测方法[JJ'中国生化药物杂志,2002,23(1):52—54 [12】FrassanitoR,RossiM,DraganiLK,eta1.Newand simplemethodfortheanalysisoftheGlutathioneadduct ofatrazine[J].JournalofChromatographyA,l998,795: 53—60[13]ThomasJ,SheaO,LunteSM.Selectivedetectionof freethiolsbycapillaryelectr0ph0resis—electrochemistryUS—ingagold/mercuryamalgammicr0electr0de[J].AnalChem, 1993.65(3):247—250[14]上海市医学化验所.临床生化检验(上)[M】.上海:上海科技出版社,l979[15]刘娟,王雅琴等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较[JJ.北京化工大学,2004,31(3): 35—38ShandongFoodFermentation——29。
gsh测定原理
gsh测定原理宝子们！今天咱们来唠唠GSH测定原理这个超有趣的事儿。
GSH呢，就是谷胱甘肽，它在咱们身体里可有着大作用呢。
就像是身体里默默守护的小卫士。
那要测定它的含量或者了解它的一些情况，就有专门的测定原理啦。
咱先从一种比较常见的测定方法说起吧。
有一种方法是利用它的还原性。
你想啊，GSH就像一个超爱奉献电子的小天使。
在特定的反应体系里，它能把其他物质还原呢。
比如说，和一些有颜色的化合物反应，那些化合物本来有着自己独特的颜色，就像穿着漂亮衣服的小模特。
可是一旦和GSH碰上了，GSH就把电子给了它们，这一给啊，那些化合物就像是被施了魔法一样，颜色发生了变化。
这就好比小模特突然换了一身风格完全不同的衣服。
我们就可以根据颜色变化的程度来推断GSH的量啦。
就像是看小模特换装后的惊艳程度来判断GSH这个小天使的能力强弱呢。
还有一种测定原理是和酶有关的哦。
酶就像是身体里超级高效的小工匠。
有一些酶对GSH特别敏感。
它们就像专门寻找GSH的小侦探。
当GSH出现在它们面前的时候，就会发生特定的反应。
比如说，有的酶会和GSH结合，然后产生一些新的物质。
这些新物质可能会发出荧光或者产生其他可以被检测到的信号。
这就像是小侦探找到宝藏后发出的信号一样。
我们通过检测这些信号的强弱，就能知道GSH的多少啦。
这就好像是根据宝藏发出的光芒大小来判断宝藏的价值呢。
再说说色谱法测定GSH的原理吧。
色谱法就像是一场赛跑比赛。
GSH和其他物质都在一个特殊的跑道上，这个跑道就是色谱柱。
它们在里面跑的时候呢，由于各自的特性不同，就像运动员的速度和耐力不一样，所以跑的快慢就不一样。
GSH会在某个特定的时间从色谱柱里跑出来，就像运动员冲过终点线一样。
我们通过检测它跑出来的时间和它的峰面积之类的参数，就能知道GSH的含量啦。
这就好像是看运动员冲线的先后顺序和他冲线时的气势来判断他的实力呢。
宝子们，GSH测定原理虽然听起来有点复杂，但就像解开一个个小谜题一样有趣。
谷胱甘肽的测定实验报告
一、实验目的1. 了解谷胱甘肽在生物体内的作用和重要性。
2. 掌握谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
3. 通过实验，提高实验室操作技能和数据分析能力。
二、实验原理谷胱甘肽（GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的天然三肽，具有强大的抗氧化作用。
在生物体内，谷胱甘肽参与多种生物化学反应，包括抗氧化、解毒、细胞信号传导等。
本实验采用比色法测定植物组织中谷胱甘肽的含量。
比色法测定谷胱甘肽含量的原理如下：1. 在一定条件下，还原型谷胱甘肽（GSH）与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）反应，生成黄色的2-硝基5-巯基苯甲酸（TNB）。
2. 通过测定TNB在特定波长下的吸光度，可以计算出样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料与仪器1. 材料：植物组织（如芦笋、花椰菜等）、DTNB溶液、EDTA-Na2溶液、Na2HPO4溶液、NaH2PO4溶液、蒸馏水等。
2. 仪器：可见光分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器等。
四、实验步骤1. 样品制备：取一定量的植物组织，加入适量的蒸馏水，用匀浆器充分匀浆，制成匀浆液。
在低温高速离心机中以3000 r/min离心10分钟，取上清液作为待测样品。
2. 标准曲线绘制：分别配制不同浓度的GSH标准溶液，按照实验方法测定其吸光度。
以GSH浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：取一定量的待测样品，按照实验方法测定其吸光度。
根据标准曲线，计算出样品中谷胱甘肽的含量。
4. 数据处理：将实验数据输入计算机，进行统计分析，得出实验结果。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.046x + 0.0058，相关系数R2 = 0.9986。
2. 样品测定：取一定量的芦笋匀浆液，按照实验方法测定其吸光度，计算得到谷胱甘肽含量为0.023 mg/g。
3. 数据分析：通过实验结果可以看出，植物组织中谷胱甘肽含量较高，说明植物具有较好的抗氧化能力。
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植物生理学模块实验指导
玲主编
科学
还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）
【实验目的】
了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
【实验原理】
谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。
2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
【器材与试剂】
1.实验仪器与用具
研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计
2.实验试剂
50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na
2
-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶
解稀释至100ml。
再称取186mg Na
2-EDTA·2H
2
O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。
0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。
0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。
4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。
现用现配。
100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。
3.实验材料
同抗坏血酸。
【实验步骤】
1.标准曲线制作
取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。
以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。
以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。
项目试管号
0 1 2 3 4 5 100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.1mol/L pH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
4mmol/L DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol 0 20 40 60 80 100
2.提取
取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、12000g离心20min。
收集上清液5mmol/L Na
2
来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。
3.测定
取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml 4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。
以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。
另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。
向一支试管加入0.5ml 4mmol/L DTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液
（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min。
按照制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在
波长412nm处的吸光度，分别记作OD
s 和OD
c。
重复3次。
【计算结果】
显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（OD
s
）和空白对照管反应混合液的吸光度
（OD
c
）。
根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。
还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）
式中，n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总
体积（ml）；V
s
为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。
【注意事项】
1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。
在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。
3. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。