动物肝脏DNA提取和鉴定

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细胞破碎方法—机械物理法：
• 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石 英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使 用。
• 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升 温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多 次。
• 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十 毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底 破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
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DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电
场中向正极移动（电荷效应） 。
DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关
外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶
的分子筛效应）。
电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶
（ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的
0.1
注：DNA片段在5-500bp之间时精，选p一pt 般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAG14E）
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度
快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电
泳。
（2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率
高，重复性好。
实验五
动物肝脏中DNA的制备和鉴定
学时：6
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一、实验目的：
1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3、学习核酸染色的方法。
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2
二、实验原理:
（一）动物肝脏DNA制备原理
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点：
➢ 如何选材，如何破碎组织细胞？
浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以
被破碎。
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细胞破碎方法—化学方法
• 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞， 可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与 研磨法联合使用。
• 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低 浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子 大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
பைடு நூலகம்
（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链 环状DNA.
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳
分离。
琼脂糖浓度/%
0.3
0.6
0.7
0.9 1.2 1.5
2.0
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-
➢ 用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然 后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿 相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95％乙醇溶液 可将DNA钠盐沉淀出来。
➢ 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直 接从生物材料中提取DNA。
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纯的DNA样品的获得
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细胞破碎方法—机械物理法
• 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－ 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞 内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶 胀破碎。
• 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。使用时注意降温，防止过热。
• 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量 EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低 DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的
DNA。
➢ 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中
低温保存。
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（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电 泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已 成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半 乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖 和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电 泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗 作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至 更少的DNA。
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琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。
（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外
光检测及定量测定。
（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制
成干膜可长期保存。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究
中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相
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(三)除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中
溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很
低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，
利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核 蛋白分离开来。
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(四)除去蛋白质的方法
确切位置。
溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的
两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的
激发下发出橙黄色的荧光。
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荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光， 并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm 和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB 发出波长为590nm的红橙色荧光。
➢ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核
蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除 去蛋白质。)
➢ 设法除去RNA的污染；
➢ 防止DNA酶的降解作用；
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选材
要提取动物组织DNA，一般选择细 胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如 胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。