环境毒理学实验教案

青海大学生态环境工

程学院

环境毒理学实验报告

科目：环境毒理学

姓名：田成龙

学号：1200602036

实验一动物试验的一般操作技术

一、目的与要求

毒理学的许多试验研究，主要通过动物实验来进行。而实验过程中技术及生物材料的收集是否恰当，直接影响实验结果的质量。因此，毒理学实验工作者必须正确地掌握动物实验中的一般操作技术，这是保证试验工作成功的基本条件之一。本实验要求掌握动物的捉拿、固定、麻醉、编号、采血、处死方法和解剖检查。

二、实验内容和方法

（一）实验动物的捉拿和固定方法

1、小鼠：捉拿时先用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，在其向前爬行时，右手向后拉尾，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤，将其固定于左手手心中，拉直四肢并用左手无名指压紧尾和后肢，右手即可作注射或其他实验操作。取尾血及尾静脉注射时，可将小鼠固定在金属或木制的固定器上。

2、大鼠：大鼠抓取方法基本同小鼠，抓大鼠时若操作者不熟练，或者大鼠特别凶猛，操作者最好戴上防护手套(帆布或硬皮质均可)。如若是灌胃、腹腔注射、肌肉和皮下注射时，可采用与小鼠相同的手法，即拇、食指捏住鼠的耳朵及头颈皮肤，余下三指紧捏住背部皮肤，置于掌心中，调整大鼠在手中的姿势后即可操作。

3、豚鼠：豚鼠性情温和，胆小易惊，一般不易伤人，抓取时，先用手掌扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，拇、食指环握颈部，另一

只手托住臀部。如果在实验时豚鼠频繁挣扎，不宜采用此方法，因为操作者的拇、食指会随动物的挣扎越抓越紧而引起豚鼠窒息。另外，有时可用纱布将豚鼠头部轻轻盖住，操作人员轻扶住其背部或者让其头部钻到实验人员的臂下，然后进行实验操作。

4、家兔：一手抓住兔颈部的被毛与皮肤，另一手托其臀部或腹部，使其躯干的重量大部分集中在手上。

(二)实验动物的编号、标记和去毛方法

1、编号和标记方法：在动物实验中，为了使实验动物个体间或组间区别开来，便于对每个实验动物的反应情况进行观察，必须对实验动物进行编号、标记。标记的方法很多，但基本原则是：号码清楚、耐久、简便、易认和适用。

（1）临时性标记：

染色法：染色法是用化学剂在动物身体明显部位如被毛、四肢等处进行涂染，或用不同颜色等来区别各组动物，是实验室最常用、最容易掌握的方法。常用的标记溶液有：①3％-5％苦味酸溶液（黄色）；

②0.5％中性红或品红溶液（红色）；③2％硝酸银溶液，(咖啡色，涂后需光照10min)；④煤焦油酒精溶液（黑色）；⑤龙胆紫溶液（紫色）。

涂漆或贴胶布：用油漆在动物角或体表涂漆进行标记，或用胶布贴在动物腿或翅上进行标记，也都是效果较好的临时性标记方法。

（2）半永久性标记：

挂牌法：挂牌法可用来标记多种动物，并多数将塑料、铝或钢片制成的牌固定在实验动物耳朵内侧面上作为标记。一般用于兔、豚鼠

标记。犬、猴、猫等动物有时可挂在颈部或笼箱或链条上。

戴项圈法：先将号码冲压在圆形或方形铝或不锈钢制作的金属牌上，长期使用不生锈。然后，将标有号码的金属薄片固定在拴动物的皮带圈上，将此圈固定在动物颈部。

（3）针刺法：

人工针刺号常用于兔的标记，先用手拔去兔耳的被毛，人工针刺号码，刺后涂以酒精黑墨即可。目前有市售的兔用打号器，原理与此相同，附带有不同数字和符号的针刺字号。可根据需要选用。字号安装在打号器上打号后，用黑墨涂在打号局部，数天后黑墨浸入皮下，显示出蓝黑色字号。一般来说，小型动物适宜用打耳孔法和染色法，中型动物适用挂牌法、针刺法和烙印法。

（4）实验动物被毛的去除方法：

动物被毛常影响实验操作和结果的观察，因此实验中常需去除或剪短动物的被毛。方法有四种：剪毛法：动物急性实验中常用此法。拔毛法：兔耳缘静脉注射或取血时以及给大、小白鼠作尾静脉注射时常用此法（液体石蜡,凡士林）剃毛法：大动物作慢性手术时常用此法。脱毛法：一般大动物作无菌手术的术野准备或观察动物皮肤血液循环和病理变化时常采用此法。

（三）实验动物的给药方法

1、注射法给药：家兔耳缘静脉注射大、小鼠尾静脉注射。

2、摄入法给药：家兔、大鼠、小鼠灌胃法。

3、涂布法给药

(四)实验动物的麻醉方法

1、全身麻醉法：吸入法，注射法

2、局部麻醉法：浸润麻醉，表面麻醉

（五）实验动物各种体液的采集方法

实验动物需要采集各种体液如血液、淋巴液、消化液、脑脊髓液、尿液、精液、阴道内液体等。下面是几种主要体液的采集方法。

1、血液采集：

（1）大、小鼠的采血方法

（2）兔的采血法

2、尿液采集：

常用尿液采集的方法有3种：①用代谢笼收集采尿，但易为粪便污染和尿蒸发，尿量不准确；②强制排尿法，按压两侧腰背部或轻压膀胱，如不成功可用细小导尿管或塑料管缓慢插入尿道至膀胱进行导尿；③采用无菌手术法，制造输尿管瘘和膀胱瘘，可长期采集尿液。（六）实验动物的处死措施

1、蛙类：

常用金属探针插入枕骨大孔，破坏脑脊髓的方法处死。操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。如被射入，必须立即用生理水冲洗眼睛。

2、大鼠和小鼠：

（1）脊椎脱臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉，同时左侧拇指与食指用力向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。

（2）击打法：左手抓住鼠尾，提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死亡。用小木锤用力击打鼠头部也可致死。

(3) 急性大失血法：可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。

(4) 化学致死法：吸入一氧化碳，大、小鼠在一氧化碳浓度为0.2％-0.5％环境中即可致死。皮下注射士的年，吸人乙醚、氯仿，均可致死。士的年注射量，小鼠为0.76-2.0mg／kg体重，大鼠为3.0-3.5mg／kg体重。氯化钾处死大鼠剂量：25％溶液0.6ml／只静脉注入。

3、犬、猫、兔、豚鼠：

(1)空气栓塞法：向动物静脉内注入一定量的空气，使之发生栓塞而死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相混致血液成泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻梗其分支，进入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快致死。一般兔、猫等静脉内注入20-40ml空气即可致死。每条犬由前肢或后肢皮下静脉注入80～150ml空气，可很快致死。

(3)破坏延髓法：如果急性实验后，脑已暴露，可用器具将延髓破坏，导致动物死亡。对家兔也可用木锤用力锤击其后脑部，损坏延髓，造成死亡。

(4)开放性气胸法：将动物开胸，造成开放性气胸。这时胸膜腔的压力与大气压相等，肺部因受大气压压缩发生肺萎陷纵隔摆动，动物窒息而死。

(5)化学药物致死法：静脉内注入一定量的氯化钾溶液，使动物心肌失去收缩能力，心肌急性扩张，致使心脏缓慢停跳而死亡。每只成年兔由兔耳缘静脉注入10％氯化钾溶液5-10ml；每条成年犬由犬前肢或后肢下静脉注入20～30ml，即可致死。

（七）实验动物的解剖检查

1、动物解剖操作

2、内脏器官的摘出

3、内脏器官的肉眼观察

三、动物急性毒性实验前应做好哪几方面的工作?

实验二鱼类的急性毒性实验

一、目的与要求

本实验通过观察在不同受试物浓度处理下，鱼的急性中毒表现和经过，了解和基本掌握测定毒物的半数致死剂量/浓度（LD50/LC50）的方法，了解受试物剂量和生物反应的关系及计算表示方法。

二、实验原理

鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在6h、24 h、48 h、72h、96 h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50％时的受试物浓度。本实验将经过实验室驯化的鱼（保证其初始状态一致）放入不同浓度的K2Cr2O7溶液中进行96h的观察，记录不同浓度组6h、24h、48h、7h2和96h的鱼的死亡率，得出剂量—死亡率曲线，求出不同时间的LC50。

通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。

三、实验材料与方法

（一）实验材料

1、待测化学物：使用实验室制剂—K2Cr2O7（Cr6+, 2000mg/L）溶液。配制一系列的浓度梯度溶液，本试验的浓度梯度为四个浓度梯度和一个空白对照，即150，100，63、39、0（mg/L）。每组五个同学，自己配制不同浓度系列的K2Cr2O7溶液。

2、实验动物：锦鲤（从鱼市购买），用曝气后的自来水驯养3天，补充氧气以保证溶解氧的浓度。

（二）实验条件及处理：静态方法

1、预试验：一般用3～5个动物, 用对数比例形成的系列浓度，如 0.01、0.1、1、10、l00 mg/L、同时做一对照（如受试物为废水，采用体积百分比浓度，如 0.01、 0.1、1、10、100%) 从中寻找理想的范围（因为时间限制，本实验学生不做预试验）。

2、正式试验：计算并配制K2Cr2O7系列浓度的溶液，选择健康的鱼，放入不同浓度的0、39、6

3、100和150mg/L的K2Cr2O7溶液中，每个浓度的鱼缸里加入6条鱼，设1～3个平行。在6h、24 h、48 h、72 h、96 h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡，观察并记录死鱼数目后，观察记录死亡鱼的数量并将死亡个体挑出。在试验开始后6 h观察各处理组鱼的状况，同时记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。（理论上试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期间，每天至

少测定一次。至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的受试物浓度）。试验结束时，对照组的死亡率不得超过10％。

四、结果与讨论

1、计算LC50:以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线，统计计算出 6 h、24 h、48 h的半致死浓度（LC50）值，并计算95％的置信限。如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死亡的最高浓度和引起100％死亡的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的几何平均值（几何平均值等于n个数值的乘积开n次方，如本实验LC50的几何平均值等于不引起死亡的最高浓度乘以引起100％死亡的最低死亡浓度开2次方）。

2、毒性评级：依据LC50值的大小，依据表1进行毒性分级评价。

表1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准

鱼起始LC50（mg/L）＜11～100100～10001000～10000＞10000 毒性分级剧毒高毒中等毒低毒微毒（无毒）

K2Cr2O7

3、实验结果及讨论：

实验三血清谷丙转氨酶活性的测定

一、目的和要求

（一）学习测定谷丙转氨酶活性的原理。

（二）掌握分光光度法定量测定技术。

二、实验原理

转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。转氨酶种类很多，在动物、植物和微生物中广泛分布，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活力最强。正常动物的血清GPT含量很少，活性很低，但当肝细胞受损时（如肝炎等病变），酶从肝细胞释放到血液中，使血清中的GPT活性显著增高。血清谷丙转氨酶（SGPT）测定是目前毒理学实验和临床上作为评价肝脏损害最常见的一个指标。

GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。因此在一定的条件下，可进行GPT 活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。

三、器材与试剂

（一）器材

新鲜家兔血清、试管及试管架、吸管、恒温水浴锅、分光光度计、移液管、电子天平、容量瓶等。

（二）试剂

1、0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液（ PBS）：

1）0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4 14.22g或Na2HPO4?2H2O 17.8g溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml,4℃保存。

2）0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO4 13.61g溶解蒸馏水中，稀释至1000ml，4℃保存。

3）pH为7.4及pH为7.55的PBS：取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液79.7ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液20.3ml混和即为0.1mol/L pH7.4PBS，取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液84.7ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液15.3ml混和即为0.1mol/L pH7.65的PBS；4℃保存。

2、标准丙酮酸溶液：称取纯化的丙酮酸钠22.0mg，以pH=7.4的PBS溶解，定溶到100ml。现用现配。

3、谷丙转氨酶底物液：称取DL-丙氨酸 1.78g，α-酮戊二酸29.2mg，以pH=7.55的PBS溶解，定溶到100mL，混匀后此底物的pH 为7.4.加氯仿数滴防腐，4℃保存（可保存两周，出现混浊即不能使用）。

4、0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取200mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L 盐酸中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动（或加热溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/L HCl定溶到1000ml。滤入棕色玻璃瓶内4℃保存。

5、0.4mol/L NaOH ：称取16g NaOH定溶到1000ml。

6、血清样品制备：取家兔血100mL于4℃静置10min，后经1500r/min离心20min分离得到血清，保存于冰箱中待用(由于血细

胞中转氨酶活性较血清中高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适当稀释后再用) 。

四、实验步骤与方法

（一）制备转氨酶标准曲线

取干燥洁净试管6支编号，并按下表加入试剂：

以各测定管减空白管520nm值差为纵坐标，各管相应的丙酮酸含量（μmol）为为横坐标绘制标准曲线。（二）血清样品的活性测定

取干燥洁净的试管2支，表明样品管及对照管，按下表顺序操作：

由标准曲线查出其相当的丙酮酸含量（μmol）。

五、转氨酶活力计算方法

本方法规定血清在37℃、pH为7.4的条件与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活性单位。结果报告以100mL 血清计算。所以：

谷丙转氨酶酶活力单位/100mL血清=标准曲线中查知丙酮酸（μmol）×1000 不同的方法测定的SGPT活力各不相同。在毒理学实验中，SGPT 活力升高，除考虑与肝脏损害有关外，还应注意动物肝内寄生虫和隐形感染等因素以及肝外原因，如心、肾、脑等组织的损伤。

六、实验结果及分析

实验四小鼠急性静式吸入中毒实验

一、目的与要求

掌握小鼠急性静式吸入中毒的基本方法，了解空气污染对机体的危害及其危害程度与毒物剂量的关系。了解苯的急性毒性症状。

二、实验原理

由于苯的挥发性大，暴露于空气中很容易挥发扩散，人和动物吸入苯后，会引起急性和慢性苯中毒。苯的急性毒性主要使神经细胞的氧化还原功能受到抑制、细胞活性下降、ATP活性下降、使中枢神经系统产生麻痹作用，表现为头痛、恶心、呕吐、神志模糊、知觉丧失、昏迷、抽搐等，严重者会因为中枢系统麻痹而死亡。利用苯的急性毒性症状可观察小鼠苯中毒的急性症状并比较计算LC50。

三、实验材料与方法

（一）实验材料

小鼠、静式吸入染毒柜（5L广口瓶代替）、滤纸、1mL吸管、吸球、托盘天平等。

（二）实验方法

取已在实验室环境中适应的健康成年小鼠、雌雄各半，称重后随机分为高、中、低剂量三个染毒组和一个空白对照组，然后在染毒装置中以设计的浓度染毒3h（参照动物急性苯吸入毒性一览表），染毒期间仔细观察并记录各组动物行为变化情况、死亡情况，染毒期间各组动物禁食。染毒装置温度应为22℃±2℃，相对湿度为30％～70％。

四、实验结果与讨论

详细描述各组动物中毒的行为表现，并讨论染毒浓度与中毒行为表现之间的关系。

表动物急性苯吸入毒性一览表

动物

浓度

（g/m3）接触时间

（min）

反应

小鼠51 240 LC50

小鼠33 420 MLC

小鼠15 120 震颤、侧卧

小鼠10 开始兴奋、后反应迟钝运动失调小鼠 5 轻度兴奋注：苯密度 0.8786 g/mL

实验五皮肤刺激试验

一、重铬酸钾的理化性质

重铬酸钾为橙红色三斜晶体或针状晶体。橙红色三斜晶系板状结晶体。有苦味及金属性味。密度2.676g/cm3。熔点398℃。可由重铬酸钠与氯化钾或硫酸钾进行复分解反应而制得。溶于水，不溶于乙醇。用于制铬矾、火柴、铬颜料、并供鞣革、电镀、有机合成等用。

二、重铬酸钾的毒作用

（一）急性毒性

1、肠胃道：

致死剂量：重铬酸钾3g。

中毒症状：刺激和腐蚀肠胃道，引起恶心、呕吐、腹疼、腹泻、便血、脱水、头疼、头晕、呼吸急促等。

2、呼吸道：

中毒浓度： CrO30.015～0.033 mg/m3， Cr2O72-：0.045～0.5 mg/m3。

中毒症状： CrO3：鼻出血、声嘶哑、鼻粘膜萎缩；Cr2O72-：胃及十二指肠溃疡、肝肿大。

3、皮肤：

刺激和腐蚀作用，引起皮炎或溃疡等。

（二）慢性毒性

1、呼吸道：

由于刺激和腐蚀作用引起鼻炎、咽炎、支气管炎。

2、皮肤：

皮炎、湿疹、皮肤溃疡。

3、全身性症状：

头疼、贫血、消化不良、肾脏损害、肺炎、支气管哮喘、神经衰弱、高血压、高血脂、冠心病、肺心病。

（三）“三致”性

六价铬和三价铬均有致癌作用，三价铬可透过胎盘屏障对胎儿致畸，六价铬具有较强的致突变作用。

三、实验目的

观察重铬酸钾对哺乳动物皮肤的刺激或腐蚀作用，初步估计人体接触该外来化合物时可能出现的类似危害。

四、实验原理

在实验动物体表一侧脱毛部位的完好皮肤上定量涂敷不同剂量的受试物，分别以另一侧作自身对照，观察吸收后的动物出现的各种中毒表现并评价刺激反应的程度。

五、实验器材与试剂

1、实验动物：白色、健康且成年的家兔，体重2kg左右。

2、器材：电子称、纱布、绑带、胶布、棉球等。

3、试剂：重铬酸钾粉末、赋形剂—凡士林。

六、实验步骤

1、实验前准备：实验前24 h将实验动物脊柱两侧脱毛掉（剪或剃）, 去毛范围左右各3cm×3cm左右，不可损伤表皮。24h后，选

择皮肤健康完整无损的皮肤区域进行试验。（不应在长有浓密岛状毛的部位进行受试物实验）

2、染毒：取受试物1g用赋形剂混匀后涂布在皮肤一侧，对侧皮肤作为对照均匀涂抹赋形剂，用4层纱布覆盖涂抹区，再用无刺激性胶布和绷带加以固定，敷用时间为24h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。

3、观察：在清除受试物后的1h、24h、48h和72h分别观察并记录受试部位的皮肤反应（如：红斑、水肿），以及皮肤变化的恢复情况和时间；再按表1进行皮肤反应评分，根据1h、24h、48h和72h 各观察时点最高积分值，按表2判定皮肤刺激强度。

表1 皮肤刺激反应评分

红斑形成水肿形成积分

无红斑无水肿0

勉强可见勉强可见 1

明显红斑水肿隆起轮廓清楚 2 中等至严重红斑水肿隆起约1mm 3

紫红色斑并有焦痂形成水肿隆起超过1mm，范围扩大 4

总分8

表2 皮肤刺激强度评分

强度分值

无刺激性0～0.4

轻度刺激性0.5～1.9

中等刺激性 2.0～5.9

强刺激性 6.0～8.0

五、实验结果与评价

1、描述皮肤过敏症状

2、描述过敏皮肤是否回复及恢复情况

3、评价皮肤刺激强度