简化基因组测序

HWUSI-EAS1767:32:7:36:45680:9021:1#0-B/1 + Simple_A
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
40
Lander-Waterman
30 20
模型进行标签覆
10
盖深度的评估。
0
a.
b.
1x 2x 3x 4x 5x 6x 7x 8x 9x 10x
Read depth
图3. 测序质量结果评估
标签序列在基因组中的特异性评估
在全基因组范围内选取分布均匀的标签，标签在基因组上的特异性通过该物种已有参考基因组（全基 因组序列、BAC或Fosmid序列等）进行评估，评估结果如下图所示：
CONTENTS
新一代高密度分子标记图谱实现基因资源的高效开发和利用
1
简化基因组深度测序技术——SLAF-seq
4
一．技术原理
4
二．技术应用过程
5
三．技术应用领域
8
四．技术优势
9
基于SLAF-seq技术分子标记图谱的功能基因组学研究解决方案 12
一．基于SLAF-seq技术的单体型图谱绘制
12
二．基于SLAF-seq技术的遗传图谱绘制
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GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCGGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
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GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
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GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
15
三．基于SLAF-seq技术的关联性图谱绘制
18
四．基于SLAF-seq技术的多态性图谱绘制
22
基于SLAF-seq技术的结果展示
25
一．成功案例—水产动物高密度遗传图谱构建
25
二．成功案例—经济作物关联分析定位抗性基因
28
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
简化基因组深度测序技术 ——SLAF-seq
chromosome01
SLAF Distribution on Chromosome
chromosome02
chromosome03
chromosome04
chromosome05
chromosome06
chromosome07
chromosome08
chromosome09
chromosome10
基于高通量测序平台对于目标物种在全基因组范围 内进行多态性分子标记的挖掘和分析，大大提高分 子标记的开发效率。掌握了目标物种丰富的多态性 信息，为该物种在分子育种和遗传进化研究方面打 下坚实的基础。
BIOMARKER TECHNOLOGIES 8
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
四．技术优势
HWUSI-EAS1767:32:7:19:13444:10608:1#0-A/1 + Simple_A
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
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GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
HWUSI-EAS1767:32:7:45:45310:60600:1#0-A/1 + Simple_B
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCGGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
chromosome11
chromosome12
0M
10M
20M
30M
40M
Polymorphism_SLAF Distribution on Chromosome
chromosome01
10
5
chromosome02
chromosome03
chromosome04
chromosome05
chromosome06
Fosmid序列 转录组数据
EST序列 群体材料选择
性状调查 近缘物种信息
方案设计
根据物种基因组信息、研究需求及材料情况设计实验方案，以保证标签的密度达到实验所需的饱和度，并使标 签尽可能均匀分布在基因组上。结果展示如下：
a.
b.
图2. 利用生物信息学进行目标物种基因组评估
Tip a. 图为在100Kb的 基因组区段内能获 得的序列标签数量 在染色体上的分布 图。
三．技术应用领域
大规模种质资源研究
对目标物种的全部重要种质资源进行筛选，如整 体选取1000个以上品种，在个体水平上开发全基 因组分子标记，利用分子标记定义物种的重要单 体型区段，一次性获得该物种全部重要种质资源 的海量分子标记数据库，为该物种搭建分子遗传 进化研究平台。
高密度遗传连锁图谱构建
如果需要快速定位目标物种的单一或多个质量、 数量性状的基因组区段或候选功能基因，可以利 用目标性状差异明显的亲本进行杂交，得到分离 群体。基于极端性状分离群体进行多态性分子标 记开发，随后将分子标记与目标性状进行关联性 分析，定义与目标性状紧密相关的基因组区段或 候选功能基因。
不同个体间的多态性分析
一．技术原理
第一阶段 基于生物信息学进行方案系统设计
利用生物信息学方法，对目标物种的参考基因组（或已知BAC序列）进行系统分析，根据基因组的GC含量、重 复序列情况和基因特点等信息，设计标记开发方案，以保证其分子标记开发的密度、均匀性、效率和关联分 析的准确性。
第二阶段 SLAF-seq文库构建及测序
Tip
unique single-end read 表示所选取的 标签在基因组上的 特异性比例； unique pair-end read 表示两段序列 所确定的片段在基 因组上的特异性比 例。
图4. 标签序列在基因组中的特异性评估
7 BIOMARKER TECHNOLOGIES
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
HWUSI-EAS1767:32:7:10:50300:10163:1#0-B/1 + Simple_B
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCGGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
...
图1. SLAF-seq基本技术流程图
BIOMARKER TECHNOLOGIES 4
二．技术应用过程
研究基础
整理目标物种已有 的研究基础，包括 基因组相关信息、 转录组相关信息、 群体材料性状调查 信息及近缘物种相 关信息等。
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
基因组信息 BAC序列
直接应用于后续工作
获得的分子标记为序列信息，可以直接用来设计引物，方便开展在更大的群体内的验证等工作，与下游工作顺 利接轨。
根据获得的标记序列设计引物 在BAC文库中利用引物进行筛选
TAG..ATC
TAG..wenku.baidu.comTC TAG..ATC
TAG..ATC TAG..ATC
TAG..ATC
TAG..ATC
TAG..ATC
TAG..ATC
TAG..ATC
将筛选出来的BAC克隆进行测序
对测序获得的序列进行基因功 能注释
G704 G723
G454
G453
G767
G989 G123
G435
G545
G435
图5. 分子标记序列直接应用于图位克隆的技术思路图
G234 G545
G768
G879
G989
多性状并行研究
以区分单株的方式 进行开发，可以方 便后期进行多个目 标性状的并行研 究，达到一次开发 可以对多个性状分 别进行关联分析， 获得各自农艺性状 的相关基因:
选择目标物种作为研究材料， 构建SLAF-seq文库，根据前期 信息学方法设计的方案，筛选 特异性长度片段，应用高通量 测序技术获得海量标签序列。
第三阶段 SLAF-seq数据分析
对数据进行基本处理，对测序 数据进行评估，获得测序深度 和质量满足要求的SLAF片段， 来充分代表目标物种全基因组 信息。
大小
数据聚类
形状
颜色
9 BIOMARKER TECHNOLOGIES
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
高准确性
不同于传统分子标记形式，数字化信号和高覆盖度保证了获得标签的准确性。
chr1
CATACATTAAGGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCGGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTTTTAGCTTTGT
DNA
Digestion
Fragment Selection
High-throughput Sequencing
ACGTGGGACCACAGACTT... ACGTGGGACCACAGACTT... ACGTGGGACCACAGACTT... ACGTGGGACCACAGACTT... ACGTGGGACCACAGACTT... ACGTGGGACCACAGACTT...
b. 图为在100Kb基 因组区段内获得的 序列标签数量总体 分布图，实现95%以 上的100Kb的区段都 能获得10个以上的 标签序列。
5 BIOMARKER TECHNOLOGIES
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
信息分析
筛选多态性分子标记 比对个体间的SLAF标签，获得多态性SLAF标 签，然后筛选出用于后期关联分析或构建遗传 图谱的分子标记(右图)
chromosome07
0
0
chromosome08
chromosome09
chromosome10
chromosome11
chromosome12
0M
10M
20M
30M
40M
SLAF标签在染色体上的分布情况
多态性SLAF标签在染色体上的分布情况
群体间差异的分子标记在染色体上的分布情况
BIOMARKER TECHNOLOGIES 6
利用永久群体进行分子标记开发，根据标记间的重 组率进行Linkage study分析，构建该物种高密度 遗传图谱。对于没有基因组的物种的分子育种研究 提供有效数据。同时在全基因组水平开发分子标记 构建的高密度连锁群，可以极大提高具有复杂基因 组物种的De novo全基因组精细图谱的完整性。
目标性状相关的 基因组区段或候选功能基因快速定位
SLAF 多态性SLAF
Marker
在全基因组范围内进行的高密度的SLAF-seq分子标记开发，可以检测到SNP、InDel两种类型的多态性差异 （下图）
分子标记在染色体上的分布情况
以100Kb的基因组区段为扫描窗口，分析每条染色体上SLAF标签、多态性SLAF标签及群体中多态性分子标记的 分布情况，结果展示如下：
SLAF-SEQ TECHNOLOGY
结果质量控制
分子标记序列的准确性评估 基于第二代高通量测序平台进行高覆盖度标签开发，数字化测序信号及标签覆盖深度保证了定义多态 性标记的准确性。
Tip
Coverage percent of tags
100
a．图为测序质量
90
80
结果评估；
70
60
b.图为基于
50
HWUSI-EAS1767:32:7:64:6033:16687:1#0-A/1 + Simple_A
GGAGTAATAAATTTATTACATCATCATCAGAGTTTTAGCAXXXXXXXXXXTTGGTTGCCAAAAGCACTAGCTGAGTCTAAAAATCAAGTT
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