藻胆蛋白生物合成与光谱分析
藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展
上述的各种细胞破碎的方法 都有一定的局限
性 , 实际生产中 , 上述几种方法经常混合使用 , 以最 大的限度破碎藻体细胞 , 使藻胆蛋白溶出 。 1.3 提取方法 1.3.1 盐析法 将大量盐加到蛋白质溶液中 , 蛋白 质胶粒凝结并沉淀析出 , 因此向细胞破碎液中加入 盐溶液使蛋白质沉 淀析出 。 Ｓｉｅｇｅｌｍａ等 [ 22] 研 究表 明用 25%硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出 , 用 30%硫酸 铵可将藻蓝蛋白沉淀出 , 再用 50%硫酸铵可将别藻 蓝蛋白沉淀出 ;而也有研究者 [ 7] 认为 30%和 50%硫 酸铵盐析出的沉淀物中 , 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的 比例几乎一样 , 即无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白分开 。 陈芳等[ 19] 用 50%的硫酸铵盐析 条斑紫菜中的藻胆蛋白 。 该法使用简单方便 , 但不 利于以后的分离纯化 。 1.3.2 等电点沉淀法 汤朝晖等 [ 18] 用该法沉淀得 到了混有 3种藻胆蛋白的混合物 , 并研究了藻胆蛋 白在不同 ｐＨ值下的稳定性 , 认为藻胆蛋白对 ｐＨ值 较敏感 。 藻胆蛋白对 ｐＨ敏感 , 使 用该法时需注意 ｐＨ引起藻胆蛋白的变性 。 1.3.3 超滤法 运用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液 , 获得藻胆蛋白粗制品 。 用 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法分离 提纯藻胆蛋白 , 超滤时选用聚砜膜 , 在超滤过程中 , 无机盐和小分子蛋白质 , 包括小分子的藻毒素透过 滤膜而去掉 , 特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒 , 提高产品的安全性 。 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法是 提取藻 胆蛋白的简单易行的方法 [ 22, 23] 。 用此法提 取的藻 胆蛋白是安全无毒的 , 且易于纯化 , 脱水方便 , 产品 易于干燥 。
藻胆体与藻胆蛋白研究进展
藻胆体与藻胆蛋白研究进展摘要：蓝藻和红藻中的藻胆蛋白通过连接多肤将不同类型的藻胆蛋白按照一定的次序组合在一起,形成高度有序的超分子复合体-藻胆体,存在于光合膜的表面,作为光合作用能量吸收与传递的功能单位。
藻胆体分子量的范围介于7x106至15×106道尔顿之间, 形状及大小与藻的种类密切相关。
【1】外藻胆蛋白的分离纯化主要包括提取原料、细胞破碎法和分离纯化3个方面。
藻胆蛋白其生物活性主要表现在: 抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化和消炎活性, 提高免疫活性。
关键词：藻胆体，藻胆蛋白，分离纯化，超分子结构，能量传递，藻胆体-类囊体膜的天然架构，能量耗散机制1简介：1.1藻胆体藻胆体是由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成的超分子蛋白复合物，含有数百个开链四吡咯发色团，分子量高达几百万道尔顿。
【2】藻胆体是红藻及蓝藻中的主要捕光天线，蓝藻和红藻通过附着在类囊体膜表面的藻胆体作为捕光复合物捕获光能并将其传递到光反应中心。
藻胆体主要有半球形和半椭圆形两种。
捕获光能并高效的传递给光反应中心PS2，种种传递给中心PS1。
PS1,PS2,PBS都在类囊体膜上，其形式与高等植物不同，光合作用过程，特别是光反应过程，是由类囊体膜上的超分子复合物实现的。
【3】藻胆体可以分为两部分：核心部分－主要由别藻蓝蛋白(APC)构成；杆状复合物－主要由藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)或藻红蓝蛋白构成。
【8】1.2藻胆蛋白藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体。
细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多"天线分子"，这些"天线分子"吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的"反应中心"，在红藻、蓝绿藻和隐藻中，藻胆蛋白就充当这种"天线分子"的角色。
因此，最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作用意义。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
太湖水体中藻蓝蛋白的紫外-可见 吸收光谱特征分析
藻蓝蛋白的分光光度法定量主要依据藻蓝蛋白在500~700nm 的吸收光谱特性。Bennett公式中藻蓝蛋白的特征波长为 615nm，别藻蓝蛋白为652nm；abelson公式中分别为620和 650nm。图3（a）和（b）中，无峰Ⅰ和无峰Ⅱ光谱在 500~700nm的吸收平缓，615与620nm和652与650nm的吸收 无可分性。显然，在此情况下使用上述公式对无峰型样品 进行定量具有局限性。图3（d）中，双峰型光谱620nm附近 的藻蓝蛋白吸收特征明显，但由于待测溶液中叶绿素复合 蛋白的影响，670nm附近还具有吸收峰，且该吸收峰与藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白的吸收峰重叠。因此，今后还需要开展 更多的对比实验工作来分析叶绿素复合蛋白对太湖藻蓝蛋 白浓度测定的影响，以进一步提高水体藻蓝蛋白浓度测定 的准确性。
方法 太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提 取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜 过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中， 同时加入0.05mol· L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱 冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融７次 。解冻的样品以12000r· min-1速度离心10min ，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓 冲液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。
实验部分
1 2
样品采集 于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日 、11月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采 集75个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生 物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室 的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻 、鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国sigma公司， 提纯于螺旋藻。
藻蓝蛋白别藻蓝蛋白
（3）环境监测：藻体内藻红蛋白及其它色素的不同种类及含量可通过其不同光学特征而得到区分，因而可在水体中直接检测水花，赤潮，如Cowle等报道，用一种光度计可直接探测水体中含藻红蛋白的浮游植物。
（4）在医药中的应用：螺旋藻藻蓝蛋白能显著提高机体的体液免疫和细胞免疫的能力，特别是小鼠受氢化可的松损伤后，藻蓝蛋白对其免疫功能有一定的恢复作用，因此藻蓝蛋白有望成为肿瘤放化治疗中并用的生物反应修饰剂应用于临床。藻蓝蛋白和藻红蛋白具有抗肿瘤活性，如坛紫菜藻蓝蛋白对HL-60细胞生长具有抑制作用[34];螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL-60、K-562和U937这三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用最强；R-藻红蛋白介导的光敏反应能通过诱导肿瘤细胞出现凋亡，从而有效地杀伤肿瘤细胞，是一种很有前景地光动力药物。Iijima等（1982）的研究发现藻蓝蛋白能促进免疫系统以抵抗各种疾病。哈佛医学院的Schwartz和Shklar（1986）也研究发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用。1988年，Morcos等的试验和1995年蔡心涵等的研究也证明藻蓝蛋白有光敏作用和良好的抑癌作用。张成武1995年的研究证明藻蓝蛋白对骨髓造血具有刺激作用，可用于临床辅助治疗各种血液疾病。藻胆蛋白具有性质稳定、荧光量子产率高、背景干扰小、易于同生物素抗体和糖蛋白等大分子交联等特点，作为新一代的荧光探针在临床诊断、免疫学、细胞生物学、组织化学、分子生物学等方面可代替同位素和酶作标记物。
万东华-藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究
藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究Isolation, purification of phycobiliprotein from Porphyra and itsspectroscopic properties一、实验目的和要求1. 了解藻蛋白的生理意义和功能，藻蛋白一般的纯化方法；2. 掌握盐析和凝胶层析的实验技术；3. 掌握紫外可见光谱仪检测蛋白的方法；4. 了解藻蛋白的荧光发射特性。
二、实验原理藻蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，参与光合作用的能量吸收和传递，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体中。
藻蛋白主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三类。
藻蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%～28%, 除了作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究之外，藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。
我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，是获取藻蛋白的理想资源。
选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低、得率高的优点，具有较好的利用价值。
1．蛋白质的盐析沉淀盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
2．葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
单个凝胶珠本身象“筛子”。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
藻胆蛋白的生物合成与光谱分析
藻胆蛋白生物合成与光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis ofPhycobiliprotein藻胆蛋白生物合成与光谱分析摘要：藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。
重组有藻胆蛋白（本实验只做藻蓝蛋白）基因的E. coli BL21，在含有kana（24 µg/ml）和氯霉素（40.8µg/ml）的LB培养基中培养。
当OD600达到0.5-0.6时，用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养2.5小时。
加超声缓冲液后用超声破壁离心取上清，得到藻蓝蛋白粗提液。
通过镍-亲和层析对起进行纯化。
关键词：藻胆蛋白生物合成光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis of Phycobiliprotein Abstract：Phycobiliprotein is a kind of light-harvesting chromoprotein existing in blue-green gae, red alga and cryptophyta, which includes phycoarythrin(short form PE), phycocyanin(short form PC), allphycocyanin(short formAPC), phycoerythrocyanin(short form PEC). E. coli BL21 which containsrecombinant phycobiliprotein（only phycocyanin was required in thisexperiment）gene was grown in LB medium containing kanamycin (Finalconcentration: 24μg/mL) and `chloromycetin(Final concentration:40.8μg/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.5 with 0.6,isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 1mM（Finalconcentration）and the incubation was continued an addition 2.5 h. Thecell was broken and centrifugated, then the crude cell extract( supernatant)was harvested. Furthermore it was purified by Ni-affinity chromatography. Key words：phycobiliprotein biosynthesis spectral analysis主要符号对照表PE 藻红蛋白PEC 藻红蓝蛋白APC 别藻蓝蛋白PC 藻蓝蛋白PCB 藻蓝胆素PEB 藻红胆素PUB 藻尿胆素PVB 藻紫胆素E.coli 大肠杆菌OD 光吸收值IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KPP 磷酸钾缓冲液min 分钟h 小时藻胆蛋白生物合成与光谱分析1引言1.1藻胆蛋白藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。
链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用
华中科技大学硕士学位论文链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用姓名：蔡芬芬申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：赵开弘2010-12摘要荧光免疫检测技术在现实生活中应用日益广泛，遍及环境污染物监测、医学检验、食品检验等诸多领域，发展迅速。
本研究所涉及的生物素-链霉亲和素系统（BSA）是具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的信号多级放大系统；同时藻胆蛋白的光学和物理性质非常符合新一代荧光免疫标记物的要求。
本研究以pUC57-sa质粒为模板，通过PCR反应扩增出目的基因片段sa，构建表达载体pETDuet-sa。
通过大肠杆菌异源表达，成功制备核心链霉亲和素，对其表达、活性和保存条件等方面进行研究，其分子量为59.2KD，理论活性为16.5u，实测活性16.3u，冻干后可以稳定保存。
将SA-CpcB、藻红胆素合成酶及藻胆蛋白裂合酶进行大肠杆菌体内共表达，得到融合色素蛋白SA-CpcB-PEB。
检测SA-CpcB-PEB的荧光活性，同时将其用于BSA 系统中进行荧光免疫检测，表明SA-CpcB-PEB同时具有藻胆蛋白的荧光特性和SA 与生物素结合的能力。
将SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于BSA荧光免疫检测体系检测微量物质，证实SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于荧光免疫检测体系具有实用意义。
通过研究温度、pH、抑制剂对SA-CpcB-PEB活性以及稳定性的影响，得到其适宜保存条件是4℃、终浓度为1mM EDTA、0.05﹪NaN3、pH为中性、20mM KPB、150mM NaCl的环境，有利于其具体应用。
关键词：荧光免疫荧光探针融合蛋白链霉亲和素藻胆蛋白AbstractFluorescence immunoassay is widely used by environmental pollutants monitoring, medicinal testing, food inspecting and other fields. In this research, Biotin-Streptavidin system(BSA) is a high sensitivity, good specificity and stability of multi-level signal amplification system. Phycobiliprotein could be applied to fluorescence immunoassay, as a new fluorescence probe.The Streptavidin gene was amplified by PCR from the plasmid of pUC57-sa and cloned by the transform of enzyme sites. Core Streptavidin was successfully constructed, and molecular weight is 59.2KD, theoretical activity is 16.5u, measured activity is 16.3u, can be preserved by lyophilized powder for long time.The fusion protein SA-CpcB-PEB was prepared by reconstitution SA-CpcB with PEB in vivo in E.coli. Tested the fluorescence and the property of binding with biotin of SA-CpcB-PEB, the results show that the fusion protein retained the two proteins’s bifunctional effects. By using SA-CpcB-PEB as a fluorescence probe to detect trace substances in BSA fluorescence immunoassay, we believed it can be used for fluorescence immunoassay.By studying the temperature, pH, different inhibitors on the activity and stability of℃the fusion protein SA-CpcB-PEB, got the better storage conditions is 4, 1mM EDTA, 0.05% NaN3, neutral pH, 20mM KPB, 150mM NaCl ,which is beneficial to the specific application.Key words：Fluorescence immunoassay Fluorescence probe Fusion protein Streptavidin Phycobiliprotein缩略词（Abbreviation）pair 碱基对bp baseDTT dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸coli 大肠杆菌E.coli EscherichiaIPTG isoprophyl thio-β-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷Kan kanamycin 卡那霉素Amp ampicillin 氨苄青霉素Str streptomycin 链霉素Chl Chloramphenicol(chloromycetin) 氯霉素kD kilodalton 千道尔顿KPB potassium phosphate buffer 磷酸钾缓冲液ME β-mercaptoethanol β-巯基乙醇BSA Biotin Streptavidin System 生物素-链霉亲和素系统PEB phycoerythrobilin 藻红胆素PE Phycoerythrin 藻红蛋白SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三（羟甲基）氨基甲烷Tris tris(hydroxymethyl)aminomethanerpm revolution per minute 每分钟转数独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究
human and rat CN TF.J Neurochem,1991,57(3):1003～10125 咸海青,范 明,甘思德,等(Xian H Q,Fan M,G an S D, et al).人睫状神经营养因子的原核表达纯化及其生物效应.中国应用生理学杂志(Chinese J Appli Phsiol),1996,12(1): 21～246 Daniel M B,Stuart J E.Protein Methods.New Y ork:Wiley2Liss Press,1991.50～1607 Marston F A O,Freedman F B.Recovery and reaction of recombi2 nant proteins.Biochem Soc Trans,1988,16(1):101～1038 Marston F A O,Angal S,Lowe P A,et al.Scale2up of the recovery and reaction of recombinant proteins.Biochem Soc Trans, 1988,16(1):112～1159 Doonan S,Walter J M.Downstream processing of protein products.Biochem Soc Trans,1990,18(1):231～234Study of R enaturation of R ecombinant H uman Ciliary N eurotrophic F actor Expressed in E.coli. XIAN Hai2Qing,FAN Ming,WU Yan(Instit ute of B asic Medical Science,A cademy of M ilitary Medical Sciences,Beiji ng100850,China);Q IU Z ong2Y in(Medical U niversity of Chongqi ng, Chongqi ng400046,China).Abstract Renaturation of human cilinary neurotrophic factor expressed in recombinant bacteria,by gel filitration chromatograph,was studied.It was showed that the renaturation rate by this way was higher than that by dilution and dialy2 sis,and the protein was purified at the same time.It was a simple,rapid,good reproducibility and efficient procedure which can be used to produce ciliary neurotrophic factor in large scale.K ey w ords recombinant ciliary neurotrophic factor, renaturation,inclusion body高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究3王 勇 钱凯先董 强1)(浙江大学生物科学与技术系,杭州310027)(山东省医学科学院,济南250062)摘要 藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了Sephadex G2200、DEAE2SephadexA225、HA、Sephadex G2200的分离纯化程序。
藻胆蛋白的生物合成及光谱分析
藻胆蛋白的生物合成及光谱分析作者：邱容朱焱谢雪林作者单位：湖北师范学院生命科学学院0803班（邱容、朱焱）湖北师范学院生命科学学院0801班（谢雪林）摘要: 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻、隐藻中的捕光色素蛋白，主要成分为藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC),藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophyxoxyanin,APC)。
本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入E.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。
提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。
关键词：藻蓝蛋白生物合成光谱分析Abstract: Phycobilin , a kind of protein which can catch light ,exist in Red algae, blue-green algae, cryptomonad.It consists of Phycoerythrin(PE),Phycoerythrocyanin(PEC),Phycocyanin (PC) and Allophyxoxyanin (APC). This report presents the biosynthesis and spectral analysis of the PC, by sending the plasmids carrying the gene which can produce PC into E.coli, thus creating the engineering bacterium which can procuce PC.Through the expanding culture ,induction and the affinity chromatography，we can extract PC from the engeneering bacterium to obtain PC . Extraction of PCcan be spectral analysed by UV-visible spectrometer.Key words：Phycobilin biosynthesis spectral analysis 藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用，根据结构和光谱特性可将藻胆蛋白分为藻红蛋白、藻蓝蛋白和别构藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接多肽生物进化研究
因此，进一步深入研究藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接多肽生物进化的机 制与功能具有重要的理论和实践意义。
参考内容
青蒿素是一种由植物青蒿中提取的天然化合物，具有高效、安全、副作用小 等优点，被广泛应用于疟疾、红斑狼疮等疾病的治疗。然而，随着科学技术的不 断发展，人们发现青蒿素的生物合成途径并不清晰，且其产量较低，无法满足日 益增长的临床需求。因此，研究青蒿素组合生物合成的进展，提高其产量和合成 效率，具有重要的科学价值和实际意义。
藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接 多肽生物进化研究
01 引言
目录
02 背景
03
藻蓝蛋白组合生物合 成
04
蓝藻连接多肽生物进 化
05 结论
06 参考内容
引言
藻类作为一类生物多样性丰富、代谢能力各异的微生物，在生物圈中占据着 举足轻重的地位。其中，藻蓝蛋白和蓝藻连接多肽是藻类生物中的两个重要组成 部分，具有独特的生物合成及进化特性。本次演示将围绕藻蓝蛋白组合生物合成 及蓝藻连接多肽生物进化展开探讨，以期为相关领域的研究提供有益的参考。
3、蓝藻连接多肽生物进化对生 态系统和人类的影响
蓝藻连接多肽的生物进化对生态系统和人类产生了一定的影响。首先，它们 在维持生态平衡方面发挥着重要作用。其次，蓝藻连接多肽的进化也促进了蓝藻 细胞的适应能力，使其能在各种环境条件下生存。但是，某些蓝藻连接多肽可能 会产生毒素，对人类和其他生物的健康造成威胁。因此，对蓝藻连接多肽的研究 和管理对保障生态安全和人类健康具有重要意义。
背景
藻蓝蛋白是一种含有叶绿素a和蛋白质的复合物，广泛存在于蓝藻、红藻和 某些其他微生物中。它参与光合作用，将光能转化为化学能，并为细胞提供保护。 而蓝藻连接多肽则是一种广泛存在于蓝藻门的多肽类物质，具有多种生物学功能， 如细胞粘附、细胞壁合成等。目前，关于藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接多肽 生物进化的研究已取得了一定的进展，但仍有诸多问题亟待深入探讨。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
8海洋天然产物藻胆蛋白
皮肤癌，增强免疫力。
（2）鱼类的饲料添加剂：提高肉色质量和观赏 鱼类的外观体色。增强抗病性和营养价值。
四、微藻毒素
麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、神经性贝毒、记忆缺失 性贝毒、西加鱼毒。
多数为聚醚类，如西加鱼毒：
五、抗生素类
脂肪族化合物 酚类抑制剂 萜类 大环内酯类 氨基酸及肽类
藻红素处在藻胆体的最外层, 藻蓝素在中 间, 别藻蓝素在中心部位, 藻胆体下面是 含有叶绿素的类囊体膜。
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（一）藻胆蛋白
结构：由藻胆色素+脱辅助蛋白组成。
✓ 藻胆色素：四吡咯化合 物
✓ 半胱氨酸残基的巯基以 硫醚键共价结合。
作用：在光合作用中起捕获光能并传递 给光系统的作用。
一种水溶性的色素蛋白。
叶绿素的最大吸 收在640-680nm。
藻胆蛋白能高效率的捕获光能并传递给光系 统，通过一系列的传递，最后将光能传到叶 绿素a，进行光合作用。传递的顺序是： PEPC APC chl a。
光能可在相同或不同分子间传递，诱导共振 传递的方向是从吸收短波光的色素传递到吸 收长波光的色素。且传递效率很高。
三、藻胆蛋白
（1）光合细菌→原始藻类植物如蓝藻类， 所具有的叶绿素a可能就是由细菌绿素进化 而来的。无成型叶绿体，叶绿素a+藻胆蛋 白。 （2） →真核的红藻类，有了成型叶绿体， 但集光色素都一样，叶绿素a+ +藻胆蛋白。 但藻胆蛋白需要大量能量和物质合成，是 很不经济的原始类型。所以在比隐藻类较 为高级的种类，如在甲藻类、硅藻类，除 叶绿素a以外，只有叶绿素c，而藻胆蛋白 消失了。
在红藻和蓝藻中，藻胆蛋白通过连接多肽组 成高度有序的超分子复合体-藻胆体，有“锚” 蛋白将其“锚”在光合膜的表面作为光合作 用与捕光色素系统。
藻蓝蛋白别藻蓝蛋白
50%硫酸铵沉淀得藻蓝蛋白。收集以上两步沉淀用10mlpbs溶解
置于透析袋中2000ml10m mol/l
12小时去除铵离子
allophycocyanin APC：蓝色蛋白晶体，分子量为104 kDa与含巯基的蛋白耦联。用于多标记流式技术和生物芯片检测，633nm/662nm。
2，carboxyfluorescein一种常用荧光素，比FITC受荧光淬灭影响少。与氨基反应，用于蛋白核酸标记，优于FITC，488nm/525nm
取螺旋藻粉50g加入ph7的磷酸盐缓冲液300ml于4℃浸泡后至于磁力震荡搅拌器上高速搅拌30min然后再-20℃和38℃间交替冻融数次
静置30min
7000r/min 4℃离心50min
取上清液用50%饱和度的硫酸铵4℃盐析24h
得藻蓝蛋白
离心沉淀得到的藻渣用PBS溶解后超声波处理9min（功率100w。振幅25%）
（3）环境监测：藻体内藻红蛋白及其它色素的不同种类及含量可通过其不同光学特征而得到区分，因而可在水体中直接检测水花，赤潮，如Cowle等报道，用一种光度计可直接探测水体中含藻红蛋白的浮游植物。
（4）在医药中的应用：螺旋藻藻蓝蛋白能显著提高机体的体液免疫和细胞免疫的能力，特别是小鼠受氢化可的松损伤后，藻蓝蛋白对其免疫功能有一定的恢复作用，因此藻蓝蛋白有望成为肿瘤放化治疗中并用的生物反应修饰剂应用于临床。藻蓝蛋白和藻红蛋白具有抗肿瘤活性，如坛紫菜藻蓝蛋白对HL-60细胞生长具有抑制作用[34];螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL-60、K-562和U937这三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用最强；R-藻红蛋白介导的光敏反应能通过诱导肿瘤细胞出现凋亡，从而有效地杀伤肿瘤细胞，是一种很有前景地光动力药物。Iijima等（1982）的研究发现藻蓝蛋白能促进免疫系统以抵抗各种疾病。哈佛医学院的Schwartz和Shklar（1986）也研究发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用。1988年，Morcos等的试验和1995年蔡心涵等的研究也证明藻蓝蛋白有光敏作用和良好的抑癌作用。张成武1995年的研究证明藻蓝蛋白对骨髓造血具有刺激作用，可用于临床辅助治疗各种血液疾病。藻胆蛋白具有性质稳定、荧光量子产率高、背景干扰小、易于同生物素抗体和糖蛋白等大分子交联等特点，作为新一代的荧光探针在临床诊断、免疫学、细胞生物学、组织化学、分子生物学等方面可代替同位素和酶作标记物。
藻胆蛋白生物合成与光谱分析 (教案)
藻胆蛋白生物合成与光谱分析【课前预习】1．无菌操作技术。
2．凝胶电泳、锌电泳、亲和层析技术的基本原理。
【目的要求】1．了解藻胆蛋白生物合成的途径2．掌握藻胆蛋白纯化的基本方法。
3．熟悉用分光光度计和荧光光谱仪测定藻胆蛋白光谱特性的方法。
【基本原理】藻胆蛋白（phycobiliprotein）是一类结构相似的色素蛋白。
它是由藻胆色素通过和相应的脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合形成的。
根据色素种类及其与藻胆蛋白的相互作用，藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白（phycocyanin，简称PC）、藻红蛋白（phycoerythrin，简称PE）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，简称APC），在某些没有藻红蛋白而具有异形胞的蓝藻中，还有藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin，简称PEC）。
每种藻胆蛋白分别由各自的 －亚基和β－亚基构成（部分藻胆蛋白中还存在γ亚基）。
藻胆蛋白通过脱辅基蛋白质三级结构和藻胆色素相互作用，形成特定的构象，使其主要吸收450～660nm范围内的可见光。
藻胆蛋白所能捕获的光能正好可以填补叶绿素和类胡萝卜素所不能捕获的光能区（图1）。
捕获的光能由高能色素流向低能色素，最终传递到光合作用中心。
图1 色素蛋白吸收光谱藻胆色素是一类线性四吡咯化合物（分子量约600Da）。
藻胆体中一般含有300～800个共价偶联的藻胆色素。
与蓝藻藻胆蛋白结合的色素有4种。
这四种色素分别是：藻红胆素（phycoerythrobilin，简称PEB）主要存在于PE中，藻蓝胆素（phycocyanobilin，简称PCB）主要存在于PC，APC和PEC中，藻尿胆素（phycourobilin，简称PUB）主要存在于B-PE和R-PE中，藻紫胆素（phycoviolobilin，简称PVB）仅存在于PEC中。
藻胆色素来源于血红素，血红素被氧化而共轭环断裂形成胆绿素，这一过程是由相应的血红素氧化酶催化。
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E.coli BL21
实验步骤
1．活化菌种 2．扩大培养 3．生物合成 4．提取纯化 5．电泳检测 6．光谱分析
实验结果:提纯产物
Apo-proteins
CpcA
PecA
Lyases
CpcE/F
PecE/F
实验结果:电泳图谱与光谱
150
0.10
ption [a.u.]
0.08 0.06 0.04
T-型
藻胆蛋白生物合成步骤
Ho1
Heme
PcyA
PCB (phycocyanobilin)
PCB +
Lyase Phycobiliprotein subunit
Apophycobiliprotein
藻胆蛋白生物合成模型
pCDFDuet-lyase or pETDuetபைடு நூலகம்lyase pCOLADuet-apoprotein pACYCDuet-ho1-pcyA
实验项目
藻胆蛋白生物合成与光谱分析
Contents
1. 实验原理
2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 注意事项
实验原理:藻胆体结构
Phycoerythrin(PE) or Phycoerythrocyanin(PEC)
Allophycocyanin(APC) Phycocyanin(PC)
藻胆蛋白三聚体与亚基结构
100
scence [a.u.]
注意事项 1．藻胆蛋白生物合成过程必须在低温、 避光条 件下进行。 2．超声波破壁时必需在冰上进行，否则因升温导 致藻胆蛋白的失活，影响最终的光谱。
a-Subunit
b-Subunit
藻胆色素生物合成途径
藻胆蛋白裂合酶催化类型
裂合酶类型 E/F-型 催化产物 PCB-CpcA， PVB-PecA
S/U-型
CpcB-C84-PCB，PecB-C84-PCB， CpeA-C84-PEB，CpeB-C84-PEB ApcA,B,D,F-PCB
CpcB-C155-PCB ，PecB-C155-PCB