发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
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发酵工程原理与技术第二章
培养方法 分批式富集培养,连续富集培养 固体培养基
施加选择压力的分离方法
分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
施加选择压力的分离方法
连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。
返回
几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
诱变育种
诱变育种理论基础：基因突变。
自然突变：自然条件下出现的基因突变。
诱发突变：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。
诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高—获得特性优良变异菌株的几率高。
诱变育种主要步骤
出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。
前进
出发菌株诱变处理
包括：
出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定
几个应注意的问题
乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。
氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。
几个应注意的问题
（3）剂量选择
变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一 定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。
合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。
施加选择压力的分离方法
分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
施加选择压力的分离方法
连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。
返回
几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
诱变育种
诱变育种理论基础：基因突变。
自然突变：自然条件下出现的基因突变。
诱发突变：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。
诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高—获得特性优良变异菌株的几率高。
诱变育种主要步骤
出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。
前进
出发菌株诱变处理
包括：
出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定
几个应注意的问题
乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。
氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。
几个应注意的问题
（3）剂量选择
变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一 定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。
合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。
发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件
lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
发酵工程 2 发酵工业菌种
自然选育、诱变育种、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、蛋 白质工程、代谢工程技术等都被用优良生产菌 种的选育。
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管）
原种特性考擦
斜面
或摇瓶培养24h
小试培养基优化
单孢子悬液
菌悬液
挑出高产菌株
诱变处理 处理前后计数
稀释涂平板 观察单菌落形态
（三）工业生产菌种的保藏
❖ 菌种保藏的意义： 保持菌种优良性状的稳定，满足生产需要。
❖菌种保藏的基本原理： 根据微生物的生理生化特性，人为地创造
条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受 到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般 可通过降低培养营养成分、低温、干燥和缺氧 等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。
3、富集培养 通过富集培养增加待分离的目标微生物的数量。 控制培养基的营养成分：碳源或氮源； 控制培养条件：温度、pH、渗透压、溶解氧浓 度等。
4、菌种分离 平板划线分离法 稀释分离法 涂布分离法
5、菌种的筛选
对菌株的筛选必须要有一个好的方法（最 简单的方法）来加以鉴定，如颜色的变化、抑 菌圈、透明圈等。
诱变剂复合处理及其协同效应
菌种
土曲霉 土曲霉 链霉菌 金色链霉菌 (2U-84) 灰色链霉菌 (JIC-1)
单独处理
复合处理
诱变剂
紫外线 X射线 氮芥(0.1%) 紫外线 紫外线 γ射线 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外线 紫外线
突变率 (%) 21.3 19.7 不明显 4.7 31.0 35.0 6.06 1.78 12.5 9.8
化学诱变剂
常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种 类型。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂 此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
发酵工程重点总结
第一章发酵：通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需产品的生物反应过程发酵工程：利用微生物（或动植物细胞）的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的技术体系。
该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术。
发酵工业的特点？（7点）1.发酵过程一般是在常温常压下进行的生化反应，反应安全，要求条件较简单。
2.可用较廉价原料生产较高价值产品。
3.反应专一性强。
4.能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位的生物转化修饰。
5.发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。
6.菌种是关键。
7.发酵生产不受地理、气候、季节等自然条件限制。
工业发酵的类型？厌氧发酵1. 按微生物对氧的不同需求需氧发酵兼性厌氧发酵液体发酵（包括液体深层发酵）2.按培养基的物理性状浅盘固体发酵深层固体发酵（机械通风制曲）分批发酵按发酵工艺流程补料分批发酵单级恒化器连续发酵连续发酵多级恒化器连续发酵带有细胞再循环的单级恒化器连续发酵发酵生产的基本工业流程？1. 用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；2. 培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭菌；3. 扩大培养出有活性的适量纯种，以一定比例接种入发酵罐中；4. 控制最适发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；5. 将产物提取并精制，以得到合格的产品；6. 回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。
工业发酵的过程的工艺流程图？第二章1、发酵工业菌种分离筛选的一般流程?调查研究（包括资料查阅）试验方案设计含微生物样品的采集（如何使样品中所含微生物的可能性大？）样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现）菌种分离根据目的菌株及其产物特点分选择性分离方法随机分离方法(定向筛选←选择压力) (用筛选方案- 检测系统进行间接分离）富集液体培养固体培养基条件培养(初筛)菌种纯化复筛菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等2、菌种选育改良的具体目标。
--第二章工业菌种的活化及分离筛选
从自然界分离的菌种
研发部
诱变育种 扩大培养
基因工程 生产用菌种
生产车间
原料
接种
发酵罐
灭菌
发酵条件控制
培养基配置
提取车间
分离 提纯
微生物菌体
代谢产物
原料车间
产品
销售部
一、工业菌种的要求
菌种不是致病菌 能在廉价原料制成的培养基上生长，且高效合成产物
遗传性能要相对稳定，不易变异退化 具有抗噬菌体及杂菌污染能力强
发酵工程及设备 Fermentation Engineering
and Equipment
第一章 工业菌种的来源
第一节 工业菌种的活化及分离筛选
内容速览
1.1生产菌种的 要求
1.2生产菌种的 活化
1.3生产菌种的 分离与筛选
发酵产品
以下产品是发酵产品吗？
工程菌 构建
胰岛素
Figure 1. Idealized biorefinery concept. (Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.)
• IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心
• ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
• IV 中国医学科学院病毒研究所
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
• CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
• GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心
链霉菌属 链霉菌属 诺卡氏菌
花粉
土壤
发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
➢ 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 ➢ 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析 ➢ 基因工程的很好材料
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
➢ 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 ➢ 可生产乳酸 ➢ 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作
第一组 长宽比为1～2 细胞多为圆形、卵圆形； 主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包
第二组 长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用
第三组 长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用
啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：
上面酵母—发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面
下面酵母—发酵度较低，易凝集沉淀
➢ 与一般放线菌不同，菌丝体长入 培养基内，不形成气生菌丝，而在 基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端 生一个球形、椭圆形孢子。
➢ 菌落致密，与培养基紧密结合在 一起，表面凸起，多崎岖，疣状； 菌落常为橙黄色、红色、深褐色、 黑色和兰色。
➢ 可产多种抗生素，如产庆大霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
发酵工程教案(打印)
发酵工程教案(打印)第一章：发酵工程的概述1.1 发酵工程的定义发酵工程的概念发酵工程的组成1.2 发酵工程的应用领域食品工业制药工业生物化工1.3 发酵工程的发展历程传统发酵技术现代发酵工程技术第二章：发酵过程的微生物学基础2.1 发酵微生物的分类与特性细菌真菌放线菌2.2 发酵微生物的培养与筛选培养基的选择与制备微生物的分离与纯化2.3 发酵微生物的代谢调控微生物的生长曲线微生物的代谢途径第三章：发酵设备的类型与选择3.1 发酵设备的类型大型发酵罐生物反应器膜分离设备3.2 发酵设备的选择原则生产规模产品特性经济效益3.3 发酵设备的运行与维护设备的启动与停止设备的清洗与消毒设备的故障处理第四章：发酵过程的控制与管理4.1 发酵过程的控制参数温度pH值溶氧量营养物质4.2 发酵过程的控制技术自动控制系统反馈控制系统计算机控制系统4.3 发酵过程的管理与优化生产计划的制定发酵条件的优化生产过程的质量控制第五章：发酵工程的案例分析5.1 乳酸菌发酵工程案例酸奶的生产泡菜的制作5.2 酵母菌发酵工程案例啤酒的生产葡萄酒的制作5.3 放线菌发酵工程案例抗生素的生产维生素的生产第六章：发酵工程的安全与环保6.1 发酵工程的安全问题微生物的危害生物安全措施发酵罐的安全操作6.2 发酵过程中的污染控制污染的来源污染的检测与控制清洁生产技术6.3 发酵工程的环保问题废水处理废气处理固体废弃物处理第七章：发酵工程的产业化应用7.1 发酵工程在食品工业的应用面包酵母的生产乳酸菌的产业化7.2 发酵工程在制药工业的应用抗生素的产业化维生素的产业化7.3 发酵工程在其他领域的应用生物燃料的生产生物材料的产业化第八章：发酵工程的研发与创新8.1 发酵工程的新技术发展重组DNA技术基因工程技术合成生物学技术8.2 发酵工程的新设备开发高通量筛选设备生物反应器的设计自动化控制系统8.3 发酵工程的产业化挑战与机遇产业化过程中的问题产业化发展的趋势产业化政策的分析第九章：发酵工程的实例分析与评价9.1 发酵工程案例分析某乳酸菌产品的生产某抗生素的生产9.2 发酵工程项目的评价技术与经济评价环境与社会影响评价风险评价9.3 发酵工程的发展前景与建议行业发展趋势技术创新方向政策与支持措施第十章：发酵工程的实验操作10.1 发酵实验的基本操作菌种的制备与保藏发酵液的制备发酵过程的监控10.2 发酵实验的设计与优化实验设计方法发酵条件的优化实验结果的分析10.3 发酵实验的操作技能培养实验操作的安全规范实验设备的操作与维护实验数据的准确记录与处理重点和难点解析重点环节一：发酵微生物的分类与特性重点掌握不同类型发酵微生物的分类、特点及应用领域。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
发酵工程第二章 工业发酵菌种选育
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵 酒香酵母：酿酒 汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下 层向上层顺序采集； • 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况 下插入圆筒采集。如果层次要求的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 • 在采集植物根际土样时，一般方法是自 土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水 中浸渍约 20min ，洗去粘附在根上的土 壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的 土，这部分上却为根际土样。
采样的注意事项
• 1、采样时应尽可能保持相对无菌； • 2、所采集的样本必须具有某种代表性； • 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日 期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； • 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真 正的原地菌群的出现可能是短暂的； • 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存 于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采 样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态 环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
• 担子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、 橡胶物质和抗癌药物的开发。 • 藻类（alga）：许多国家已把它作为人类保健 食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油； 国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。
担子菌 硅藻
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
抑菌圈法
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
举例:产植酸酶黑曲霉的分离
植酸酶是催化植酸及其盐类水解 成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称 植酸即肌醇六磷酸脂。植酸及其 盐类是植物中磷的主要贮存形式。 植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉 米等植物的种子中，但含量较低。 细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸 酶的重要来源。
5g 土样 45ml dH2O 玻璃珠
3、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（ 丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）
食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 ；
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
如何分离磷细菌？
聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈）
发酵工程 第2章 微生物工业的菌种
（一）材料的选择
土壤 水域(海洋、湖泊、河流) 生物体内 极端环境和特殊的生态环境
（二）材料的预处理
热处理法 膜过滤法 化学药品处理
用0.01N的NaOH处理样品，可分离 得到小单孢菌。
用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L 的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。
（三）分离、筛选方案的设计
筛选模型 加选择性压力 富集培养、诱饵法 反应特性 随机分离
(四)原生质体融合技术
也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细 胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质(包括核DNA 和核外基因)进入另一个细胞。
它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗 传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性 的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下 去。
原 生简 质要 体说 融明 合
筛选模型
在抗生素的筛选过程中，为避免致 病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌 为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌 而又能代表致病菌的其它微生物作为试 验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛 选模型。
加选择性压力
加入不同的抗生素或试剂来增加选 择性，如分离真菌时，可加入抗细菌抗 生素，分离放线菌和细菌时，可加入抗 真菌抗生素。
选择、调取单菌落，转管保存
初筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
复筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
根据情况进行第二、第三……复筛 选出高产突变株，并留种保存
高产菌株的稳定性试验 菌种特性考察
高产菌种培养条件的优化试验 小发酵罐试验
放大试验、中试考查
大罐试验 生产
诱变育种应注意的几个问题
(1)出发菌株的选择 (2)复合诱变剂的使用 (3)诱变剂的剂量 (4)突变株的筛选 (5)高产突变株培养条件的优化
发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
微生物工程工业生产 水平的三个决定要素:
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
发酵工业菌种的分离筛选
调查研究（资料查阅）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试验方案设计
标本的预处理
富集培养
菌种初筛
性能鉴定
菌种保藏
标本采集 菌种复筛
2.筛选的关键：生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产 生所需产物的菌种的分类地位、分布、特征及生态环境
设计选择性高的分离筛选方法
1. 微生物分离纯化、菌种筛选的一般步骤：
（1）标本采集
•来源广泛的天然材料。 •已适应相当苛刻的环境压力的微生物类群 •更新的生态环境有待开发
（5）筛 选
初筛：（平板筛选） 高通量、快速、简便的方法
（1）. 从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基，利用简单、快速的鉴定方法，
如抗生素 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小
型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。 （2）. 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养
（2）材料的预处理
•物理方法：加热、膜过滤、离心等 •化学方法：加碳酸钙提高pH值等。 •诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落
长成后再铺平板。
（3）富集培养
σ分批式富集培养：指将富集培养物转接到新的同一种培养 基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再 取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。
0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
菌种鉴定
• 经典的分类鉴定方法
• 形态学鉴定 • 生理生化鉴定 • 血清型实验与噬菌体分型
• 现代分类鉴定方法
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
发酵工程02第二章发酵菌种选育
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发酵工程02第二章发酵菌种选育
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土 壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；
6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸 出汁和培养条件；
7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；
8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的 方法；
• 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以 减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培 养。也可洗下微生物后振荡培养。
• 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量 种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉 积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
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发酵工程02第二章发酵菌种选育
发酵工程02第二章发酵菌种选育
（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
发酵工程02第二章发酵菌种选育
二、分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常
用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如 可溶性淀粉、碳酸钙等。 变色圈法：直接用显色剂或指示剂。
生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生 物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养 条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长， 形成生长圈。 抑制圈法：琼脂块培养法。
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3、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（ 丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）
食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 ；
又如 分离解脂微生物 豆油作底物 甘油三丁酸酯为底物
中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示
菌落周围呈红色圈
罗丹明B为指示剂
荧光圈
生长圈法
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈 如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌
移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。
5、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一） 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的 控制 pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 性质，从而改变选择压力。 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物； 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培 养基上。
生产性能测定
调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 采样 增殖条件探索 第一次增殖培养
筛 选 工 作 程 序
第一次原种斜面
第一次平板分离
第二次增殖培养 根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离
第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛（1株1瓶）
第三次平板分离
第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第四次原种斜面 第三次菌种保藏
Chapter 2 continued
二 发酵工业菌种的分离 筛选
生产菌种的性能 发酵工程工业生产水平 发酵和提取工艺条件 生产设备
的三个决定要素:
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工业生产的第 一环节.
1、菌种分离与筛选工作程序
发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中 分离筛选出来的。 分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤： 样品采集 增殖培养 纯种分离
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
4、含微生物样品的富集培养
富集(enrichment)培养
是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
富集培养基配方
2%植酸钙、0.2%NH4NO3、 0.1%K2HPO4· 3H20、 0.002%CaCl2 、 0.05%KCl、 0.05%MgSO4· H2O、 0.001%MnSO4· 4H2O、 0.001%FeSO4· 7H2O、PH 5.5~7.5。
抑菌圈法
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
如何分离磷细菌？
聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈）
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。
初步工艺条件摸索
再复筛
1株3-5瓶 较优菌株
种子培养
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征
2、菌的生长温度
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性 6、容易从培养液中回收产物 3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株
举例:产植酸酶黑曲霉的分离
植酸酶是催化植酸及其盐类水解 成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称 植酸即肌醇六磷酸脂。植酸及其 盐类是植物中磷的主要贮存形式。 植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉 米等植物的种子中，但含量较低。 细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸 酶的重要来源。
5g 土样 45ml dH2O 玻璃珠
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如
筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选 1万个菌株才能得到1株有用的抗生素 据估计，筛选 工具菌采用抗生素的敏感菌 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十 分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
振摇15min
配制 筛选培养基 （150 ml / 瓶）
划线纯化 （每人1平板）
各0.5ml
4.5ml
(30℃，24～48h)
10-1 10-2 10-3 养3～5d
涂平板
30℃培养24～48h；4℃冰箱保存菌种
结果
筛选培养基配方
• （1）1%脱氧胆酸钠溶液。 • （2）氯霉素眼药水。 • （3）筛选培养基0.2%植酸钙、3%葡萄糖、 0.5%NH4NO3、0.05%KCl、 0.05%MgSO4· H2O、 0.003%MnSO4· 4H2O、 0.003%FeSO4· 7H2O、2%琼脂、PH 5.5~7.5。
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下： 1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。 2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分 3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如 NH4+），它们可能引起分解代谢阻遏。 4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+） 5）加入缓冲液以减少pH变化