发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

3、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（ 丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）
食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 ；
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下： 1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。 2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分 3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如 NH4+），它们可能引起分解代谢阻遏。 4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+） 5）加入缓冲液以减少pH变化
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的 控制 pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 性质，从而改变选择压力。 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物； 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培 养基上。
移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。
5、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一） 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
初步工艺条件摸索
再复筛
1株3-5瓶 较优菌株
种子培养
ຫໍສະໝຸດ Baidu
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征
2、菌的生长温度
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性 6、容易从培养液中回收产物 3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株
富集培养基配方
2%植酸钙、0.2%NH4NO3、 0.1%K2HPO4· 3H20、 0.002%CaCl2 、 0.05%KCl、 0.05%MgSO4· H2O、 0.001%MnSO4· 4H2O、 0.001%FeSO4· 7H2O、PH 5.5~7.5。
抑菌圈法
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
4、含微生物样品的富集培养
富集(enrichment)培养
是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
又如 分离解脂微生物 豆油作底物 甘油三丁酸酯为底物
中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示
菌落周围呈红色圈
罗丹明B为指示剂
荧光圈
生长圈法
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈 如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
如何分离磷细菌？
聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈）
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。
举例:产植酸酶黑曲霉的分离
植酸酶是催化植酸及其盐类水解 成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称 植酸即肌醇六磷酸脂。植酸及其 盐类是植物中磷的主要贮存形式。 植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉 米等植物的种子中，但含量较低。 细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸 酶的重要来源。
5g 土样 45ml dH2O 玻璃珠
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如
筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
Chapter 2 continued
二 发酵工业菌种的分离 筛选
生产菌种的性能 发酵工程工业生产水平 发酵和提取工艺条件 生产设备
的三个决定要素:
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工业生产的第 一环节.
1、菌种分离与筛选工作程序
发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中 分离筛选出来的。 分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤： 样品采集 增殖培养 纯种分离
生产性能测定
调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 采样 增殖条件探索 第一次增殖培养
筛 选 工 作 程 序
第一次原种斜面
第一次平板分离
第二次增殖培养 根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离
第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛（1株1瓶）
第三次平板分离
第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第四次原种斜面 第三次菌种保藏
抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选 1万个菌株才能得到1株有用的抗生素 据估计，筛选 工具菌采用抗生素的敏感菌 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十 分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
振摇15min
配制 筛选培养基 （150 ml / 瓶）
划线纯化 （每人1平板）
各0.5ml
4.5ml
(30℃，24～48h)
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 各100 ul (各2套)
接种斜面
30℃培养3～5d
涂平板
30℃培养24～48h；4℃冰箱保存菌种
结果
筛选培养基配方
• （1）1%脱氧胆酸钠溶液。 • （2）氯霉素眼药水。 • （3）筛选培养基0.2%植酸钙、3%葡萄糖、 0.5%NH4NO3、0.05%KCl、 0.05%MgSO4· H2O、 0.003%MnSO4· 4H2O、 0.003%FeSO4· 7H2O、2%琼脂、PH 5.5~7.5。