烟草花叶病毒的检测方法研究进展

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病毒学论文烟草花叶病毒

烟草花叶病毒摘要：草花叶病毒（Tobacco mosaic virus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损，因此得名（mosaic为马赛克，也就是拼贴之意）。

19世纪末期人们已知有某种威胁烟草作物生存的疾病，但直到1930年才确知此病毒的存在。

是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群。

烟草花叶病和番茄花叶病早为一般所了解。

叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形。

如今通过大量实验的积累，已总结出了大量的防治经验。

关键词：烟草花叶病毒综合防治前言：烟草花叶病严重危害烟叶产量和品质, 常造成巨大的经济损失, 成为优质烟叶生产的制约因素之一。

因此, 寻找一种经济、有效的烟草花叶病防治措施成为烟草生产上的迫切任务。

此篇文章将对烟草花叶病毒作详细的介绍以及综合防治，综述了烟草花叶病毒的研究发展进程。

正文：1烟草花叶病毒概论1.1烟草花叶的分类地位烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)作为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)代表种，其研究始于一个多世纪前。

Mayer(1886年)首次发现烟草花叶病,并通过实验证明其汁液具有传染性。

伊凡诺夫斯基(1892年)(D.1.Iwanowski)首次证明：TMV是由滤过性病原体(病毒)所引起的。

1898年，“病毒学之父”——贝叶克林(Beijerinck)研究发现：TMV不属于细菌，也不是微小体，是一种可滤过性的病原，一种“传染活液”或“病毒”。

斯坦利(w.M.Stanley)发现病原体是蛋白质，1935年他首次从病叶榨汁中分离到病毒状结晶，并发现这种蛋白质还含有核酸，并确定病原就是TMV。

他因为这一发现获得诺贝尔奖。

1939年，贝杰林克(Kansche)借助电子显微镜，第一次观察到杆状的TMV粒体。

此后，在病毒形态结构、理化特性及其分子生物学特性研究中将TMV作为一种模式材料，对病毒学的发展起到极其重要的作用。

昆明烟区育苗点烟草花叶病毒初侵染源的检测与分析

中图分类号：４２４；￥７￥３．１５２文献标识码：Ａ
Ｉｅｔｆａｉｎ０ｏａｃｓｉｉｕｎｃｌｍｎＦｌｅｃｒｄｄｎｉｃｔｆＴｂｃｏｍｏａｃｖｒｓＩｏｕｕｉｕ．ｕｅｉＯＴｏａｃｅｄｉｇＢｅｓｉｎｎｂｃｏＳｅｌｄＫｕｍｉｇｎｎ
ＹｎａａｅｙｏＡｃｌｒｌｃｅｃｓＹｎａｉａｇ７１０，ｈｎ；．ｕｍｉｇＣｔｒｎｈｏＹｎａｒｖｎｉｏａｃｏｏａｕｎｎＡｃｄｍｕｔａＳｉｎｅ，ｕｎｎＬｊ６４０Ｃｉａ４ＫｎｎｉＢａｃｕｎｎＰｏｉｃｌｂｃｏＣｒｒ－ｆｕｉｎｙｆａＴｐ
昆明烟区育苗点烟草花叶病毒初侵染源的检测与分析
尹跃艳，端永明４徐兴阳４邱仕芳，，，张廷金丁铭，家红，，董张仲凯
（．１云南省农业生物技术重点实验室，云南昆明６０２；．５２３２云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南昆明６ｏ２；５２３３云南省农业科学院高山经济植物研究所，．云南丽江６４０；．７１０４云南省烟草公司昆明分公司，云南昆明６０５）５０１
摘
要：烟草花叶病毒在烟草种植上为害严重。在烟草育苗前期，对育苗基质、水源、溧盘残根、育苗棚周围植物及烟草种植区病
株残体、土壤用烟草花叶病毒ＴＳＥＩＡ－ＬＳＡ试剂盒检测。结果表明，在水源、漂盘残根、烟草种植区病株残体、土壤中均可检测到烟草花叶病毒，在育苗棚周边８个科的１４种植物中检测到烟草花叶病毒，此类毒源可能成为苗期烟草花叶病发生蔓延的初侵染源。关键词：烟草花叶病毒；初侵染源；烟草

烟草苗床期普通花叶病(TMV)组织印迹检测技术研究

Figure 1. PBS sketch map at normal temperature in buffer solution 图 1. PBS 缓冲液中常温下培养示意图 DOI: 10.12677/hjas.2018.88142 969 农业科学
匡传富等
2.4.2. 第一抗血清最适浓度的确定检测 TMV 组织汁液，待测病毒血清一抗稀释倍数分别为 300、500、1000、2000、3000 倍。抗血清二抗稀释倍数均为 6000 倍。 2.4.3. 第一抗血清和二抗最佳温育时间的优化浓度不同时工作时间的确定。首先一抗稀释倍数为 3000 倍，二抗稀释倍数 6000 倍。第一组一抗、二抗连接时间分别为 30 min，恒温，不震荡。第二组一抗连接 30 分钟，与二抗连接 1 h，恒温，不震荡。第三组一抗连接 1 h，与二抗连接 30 min，恒温，不震荡。其次采取待测烟叶样品，用叶中部进行组织印迹，要求一抗稀释倍数为 2000 倍，二抗稀释倍数为 6000 倍。每个样品在封闭时仍要求 37℃恒温振荡器 60 r/min 下进行，第一组与一抗、二抗分别连接 30 min， 37℃恒温震荡。第二组与一抗连接 1 h，37℃恒温震荡。与二抗连接 30 min，37℃恒温震荡。 2.4.4. 植物最佳取样部位的选择检验采取待测烟叶样品，取待测 TMV 发病显症烟苗植株和长势相同的健康烟叶植株叶片各一片。用干净刀片切取带病毒叶片，由叶柄基部到叶尖处由上至下点十个点，每隔 1 cm 进行一次切样再点样进行组织印迹。健康烟叶点样情况一样(点样分布如图 2 所示)。 2.4.5. 感染烟草花叶病毒不同发病时间检测用组织印迹检测法检验同种烟苗接种病毒后，在不同时间病毒感染情况。取长势相同的同种烟苗 6 株，置于温和的环境下(实验温室，温度控制在 25℃~27℃，湿度控制在 80%)，用摩擦接种法，接种浓度 40 µg/ml，给六株苗子接种上 TMV 病毒，要求接种时间，地点，病毒量以及接种部位都相同。每隔 24 h 取出一盆烟苗，拔出整株，取下茎部和由下至上 4 片叶进行印迹实验。用干净刀片切取每株烟苗的茎基部、茎中部和茎尖部分，由左至右分别进行点样进行组织印迹。再切取准备好的叶片(叶 1、叶 2、叶 3、叶 4)，从叶柄处和叶脉中部各切取一段进行组织印迹(点样分布如图 6 所示，显色情况如表 1 所示)。 2.4.6. 不同品种烟草花叶病毒发病情况检测用组织印迹检验方法，检验从綦江地区采集的烟苗样本(KRK26、K326、云烟 87、红大、云烟 97 五个品种的烟苗)，以及部分马铃薯样本。实验过程中再加上本实验室 TMV 已经显症的烟苗样本做阳性对照，以及健康烟苗做空白对照。取各样品植株叶柄，用干净刀片横切并在 NCM 上进行点样，点样情况如图 6 所示图片，每一品由上至下 1~5 分别为各样品按 1~5 编号点样情况。

烟草花叶病毒(TMV)基因编码蛋白研究进展

烟草花叶病毒（TMV）基因编码蛋白研究进展摘要：烟草花叶病毒属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.本文综述了近年来有关这四个蛋白质的表达、功能和外壳蛋白合成抑制物等方面的一些研究结果，以期为这方面的研究提供理论依据。

关键词：TMV基因编码蛋白表达功能烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）属于烟草花叶病毒属。

该属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.其中126kD和183kD蛋白参与病毒的复制，称为RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亚基；183kD的蛋白是126kD 蛋白的阅读框终止子通读的产物；30kD蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白（Movementpro2tein，MP）；17.5kD的蛋白为病毒的外壳蛋白（Capsidprotein，CP）。

烟草花叶病毒（TMV）侵染后30～40小时感病叶内126KDa和183KDa蛋白质达到高水平；外壳蛋白在侵染后10小时才开始合成，30～40小时达到高峰；相比之下，体内30KDa蛋白质早就出现，在侵染后20小时达最高值，这很可能与30KDa涉及负责病毒在细胞与细胞间的转运有关。

1 126kD/183kD蛋白1.11 26kD/183kD蛋白表达烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因RNA的5′端时即侵染后1-10分钟内，翻译开始首先合成126KDa和183KDa的两种蛋白质。

183KDa 是由126KDa基通读而产生，Tyr插在这个琥珀型终止子上，有6个保守的核苷酸［1］。

1.21 26kD/183kD蛋白功能烟草花叶病毒复制所需依赖的RNA的聚合酶由两部分组成：一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚基组合成有专一性的全酶。

[2]183KDa有RNA依赖的RNA聚合酶的结构，126KDa的C端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构［3，4］。

烟草花叶病毒病的分子鉴定

烟草花叶病毒病的分子鉴定罗朝鹏;杨军;金立锋;李锋;王信民;金光辉;宋纪真【摘要】为了建立烟草病毒病的分子鉴定体系,采用TMV,CMV和PVY 3种病毒的检测引物对烟草花叶病样品进行了RT-PCR扩增,并从核酸水平上对病毒基因序列进行了分析.RT-PCR鉴定结果显示,该病害病原为TMV,测序结果显示扩增产物长923bp,序列比对后发现该序列与TMV 3个中国分离物的同源性高达97%,序列分析结果表明该段序列位于TMV基因组3'末端,包含部分MP基因、完整CP基因和3'端非编码区.对CP基因进行了系统进化分析,且该序列已成功登陆GenBank.【期刊名称】《烟草科技》【年(卷),期】2010(000)007【总页数】4页(P58-61)【关键词】烟草;病毒;分子鉴定;进化树分析【作者】罗朝鹏;杨军;金立锋;李锋;王信民;金光辉;宋纪真【作者单位】中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001;中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001【正文语种】中文【中图分类】S432.41Keywords:Tobacco;Virus;Molecular identification;Phylogenetic tree analysis Abstract:In order to establish a system for molecular identification of tobacco virus diseases，primers for TMV，CMV and PVY detection were used in RT-PCR for TMV samples，and the genetic sequence of the amplified product was analyzed at nucleic acid molecular level.The results of RT-PCR indicated that the pathogen was TMV and the amplification product was 923 bp in length.NCBI BLAST showed that it shared97%sequence identity with 3 China isolates.Sequence analysis indicated that the fragment located at the 3'terminal of TMV genome and included a part of movement protein(MP)gene，complete coat protein(CP)gene and 3'terminal’s non-coding region.The phylogenetic tree analysis of CP gene was conducted，and the sequence has been logged in GenBank.病毒病是烟草上发生最普遍、危害最严重的病害。

烟草花叶病发生规律及生物源抗病毒研究进展

烟草花叶病发生规律及生物源抗病毒研究进展摘要:从烟草花叶病的病原､发生规律､植物源抗花叶病毒物质和微生物抗花叶病毒物质等方面,对近年来的研究成果进行了简要综述｡关键词:烟草花叶病;植物;微生物;抗病毒活性物质Progress in Occurrence Regularity and Bio-antivirus Material of Tobamovirus Abstract: The research achievements on mosaic disease of tobacco in recent years were briefly summarized from the aspects of pathogen, occurance regularity, botanical and microbial antivirus material.Key words: mosaic disease of tobocco; plant; microorganism; antivirus material烟草花叶病毒寄主范围非常广泛,可侵染36个科350多种植物,且抗逆性极强,在世界各烟区普遍发生,是危害烟草生产最主要的病害之一[1]｡我国南北烟区均常有发生,尤其南方烟区受害较重,田间株发病率一般5%~20%,有的田块高达90%~100%,早期发病的田块损失可达50%~70%,甚至绝收[2]｡烟株感染花叶病后,烤晒后颜色不均,烟叶品质变劣､等级下降,极大地影响烟农的经济效益[3]｡烟草花叶病由烟草普通花叶病毒(TMV)､黄瓜花叶病毒(CMV)或马铃薯Y病毒(PVY)引起[12]｡烟草普通花叶病毒的主要初侵染源是混有带毒残体的种子和土壤､带毒烟叶等｡即使是倾倒在垃圾堆中或其他场所并随堆肥返田的带毒烤烟残体都具有传病能力[13]｡烟草普通花叶病毒主要借接触摩擦传染｡因此,当烟田发病后,田间整枝打顶､病叶健叶相互摩擦造成的叶面微伤,以及烟田中耕除草或地下害虫为害造成的根系微伤,都会引起再侵染,使病害进一步扩大蔓延｡品种单一､苗床选址不科学､连作严重､麦烟行比不规范､卫生栽培不到位､移栽时遭遇干旱天气､防治不及时等是造成烟草普通花叶病发病较重的主要原因[14]｡黄瓜花叶病毒不能在干叶或病残体内越冬,其初侵染源主要是感病的黄瓜､西红柿､白菜等栽培或野生寄主植物,其传播除伤口汁液接触摩擦外,更主要的是借蚜虫传播[15]｡经伤口侵入的黄瓜花叶病毒在烟草组织内比烟草普通花叶病毒增殖和移动速度要快得多,在24 ℃条件下,通常48 h可出现病斑,72 h内可发生再侵染,1周内能形成系统症状[13]｡马铃薯Y病毒和黄瓜花叶病毒相似,在干叶或病残体内不能长期存活,病毒主要在茄科植物和某些杂草上越冬｡越冬寄主上的病毒由蚜虫传入烟田或苗床,蚜虫吸食1min后即可传毒,但连续吸食植株后传毒能力下降,甚至完全丧失[16]｡烟草花叶病的发生流行与环境､耕作措施､抗性等因素有关｡若温度过高(>37 ℃)､过低(<10 ℃),或光照太弱都会发生｡由CMV引起的烟草花叶病,蚜虫发生多时,发病就重｡偏施氮肥,烟株生长柔嫩,较易感病｡土壤瘠薄､排水不良的烟田,植株生长衰弱,发病也重｡连作地较轮作地发病重[13]｡烟草种间对TMV抗性有明显差异:黄花烟､红花烟､白花烟都容易感染普通花叶病,而心叶烟高度抗病;南美洲野生烟则高度耐病;普通烟与心叶烟或野生烟杂交可获得抗普通花叶病的品种｡至今还未找到抗黄瓜花叶病毒的烟草品种｡2植物源抗病毒物质在烟草花叶病防治上的应用植物源抗病毒物质是从各种植物中提取的抗病毒或者钝化病毒的物质｡日本的原征彦等最早用从绿茶或红茶叶中萃取的单宁酸或多糖,特别是儿茶酚化合物保护作物免受TMV病毒侵染,并利用其提取物抑制病毒在作物间扩散[17]｡此后,大量的研究投入到关于植物源抗病毒物质中,不断涌现出各种植物源抗病毒物质的研究报道,并探讨了一些抗病毒物质的抗性机理｡目前报道的主要是从中草药中提取抗病毒物质,一些是报道其抗病毒能力｡如朱水方等[18]证明,烟草在接种TMV病毒前72 h和接种后24 h喷施连翘､大黄､板蓝根提取液,疗效均在90%以上,病毒浓度下降60%~70%;薛小平等[19]用瑞香狼毒(俗称断肠草)的水提取液喷施烟叶后10 d对烟草黄瓜花叶病的防治效果与20%病毒A可湿性粉剂相似,而且病毒浓度下降43.2%~45.9%;翟梅枝等[20]的实验结果表明,莲､榕树､柿子､杨梅､水蜈蚣､叶下珠､羊蹄甲､心叶落葵薯等对TMV 的抑制效果在90%以上;喻大昭等[21]分别用商陆､羊蹄和板蓝根的乙醇提取物进行了防治烟草花叶病的田间试验,试验结果表明商陆的乙醇提取物具有一定的治疗效果｡一些研究初步证明了有的植物提取物能抑制病毒复制或者钝化病毒｡如林存銮等[22]证明小藜和玉簪对病毒TMV有抑制复制和体外钝化作用;侯玉霞等[23]的研究表明,紫草､月季的抽提物具有高效选择性的抗病毒作用,它们既抑制TMV的增殖,又抑制TMV对叶绿体的破坏并促进寄主植物光合作用;姚宇澄[24]从牛心朴子草中提取了抗病毒活性物质吲哚里西啶生物碱;陈启建等[25]证明从三叶鬼针草中提取的黄酮甙对TMV的抑制效果可达91.3%;沈建国等[26]研究发现臭椿和鸦胆子的乙醇提取物不仅能有效抑制TMV侵染,而且对TMV的增殖也有明显抑制作用,并对烟草花叶病具有较好的防治效果｡一些研究更为详细和清楚地证明了提取物的抗病毒机理｡如陈启建等[27]的研究表明,从新鲜大蒜中提取的挥发油与烟草花叶病毒混合后可使完整的病毒粒体断裂且对病毒衣壳蛋白的体外聚合过程有明显的抑制作用,而对病毒的核酸侵染力无显著影响,喷施大蒜挥发油可显著提高烟草体内过氧化物酶和多酚氧化酶的活性,提高烟草的抗病性｡张正坤等[28]从药用植物鸦胆子中分离到的一种苦木苦味素类化合物——鸦胆子素D,探讨了鸦胆子素D对烟草抗烟草花叶病毒的诱导抗性和保护作用,结果表明,鸦胆子素D能够系统性地诱导烟草体内POD,PPO,PAL以及SOD活性的提高;能够抑制烟草因感染TMV造成的叶绿素含量的下降以及MDA含量的升高;诱导烟草产生新的POD和PPO的同工酶;阻止TMV造成的烟草体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低｡鸦胆子素D能够诱导烟草产生对TMV的抗性并对感染TMV的烟草起到保护作用｡3微生物源抗病毒物质在烟草花叶病防治上的应用微生物提取物对烟草花叶病毒的抑制作用研究始于20世纪初期,1937年Johnson等的试验结果表明,细菌和真菌的代谢物对烟草花叶病毒均有不同程度的钝化作用｡此后大量研究也证明一些微生物来源的物质有抑制烟草花叶病的能力｡当然一些研究只证明了抑制效果,如喻大昭等[29]的研究结果表明,香菇的水提物对TMV具有一定的预防或治疗效果;卢娜等[30]用平菇发酵菌丝PBS提取液防治烟草花叶病的研究结果发现黑平菇PBS缓冲液提取液对TMV抑制率最高,为66.54%,显著好于其他7个平菇菌株;朱春玉等[31]研究了嘧肽霉素对烟草花叶病毒在不同寄主上的防效,结果表明,嘧肽霉素对不同系统寄主上的TMV引起的病毒病害都具有很好的防效,对TMV侵染烟草引起的烟草病毒病害的预防较为显著,抑制率达80.4%｡陈力力等[32]从神农架国家自然保护区土样中分离筛选到1株抗烟草花叶病毒的放线菌HNS2-2,该菌株培养滤液与烟草花叶病毒混合后接种在枯斑寄主曼陀罗和系统侵染寄主普通烟K326上,对两寄主的枯斑抑制率分别为92.62%和61.88%;接种病毒前､后施用HNS2-2菌株培养滤液对两寄主的枯斑抑制率分别为83.78%､67.26%和54.06%､42.37%｡马学萍等[33]从钝化､预防､治疗3个不同时期,在心叶烟上测试了鸡油菌､蘑菇､香菇､平菇､茶树菇､鸡腿菇､真姬菇､金针菇等8种食用菌乙醇提取物水溶液对烟草花叶病毒的抑制作用,结果表明8种食用菌提取物在体外都具有钝化病毒及抑制病毒侵染的作用,除鸡油菌外,其他7种食用菌提取物对TMV有不同程度的治疗作用｡一些研究初步证明了微生物源抗病毒物质的抗病毒机理｡如付鸣佳等[34]利用阴离子交换层析和凝胶层析的方法从榆黄蘑中提取出一种蛋白,经实验证明该蛋白对烟草花叶病毒具有较好的抗性;王伟伟等[35]的研究表明,枯草芽孢杆菌W-QX-1的碱性蛋白酶对TMV的体外钝化作用明显,在酶液浓度为50 mg/L时,其钝化效果即可达到53.40%,同时该酶对TMV的初侵染和体内复制增殖也具有一定的抑制能力,在TMV侵染前24 h施用浓度为200 mg/L碱性蛋白酶液抑制其侵染力的效果达到50.35%,而在TMV侵染后抑制其复制增殖的作用并不明显｡吴艳兵等[36]从毛头鬼伞子实体和菌丝体初步纯化出的多糖,对TMV具有较强的体外抑制和抗病毒侵染作用,对TMV具有明显的体内抑制复制效果,在TMV接种前施用可以显著降低TMV的侵染能力｡当然,目前的生物源抗烟草花叶病物质的研究还处于积累阶段,作用物质和作用靶标还很不清楚,因此其作用机理还无法阐明,还需要广大植物保护研究者继续努力,为实现安全､高效､生态地防治烟草花叶病奠定坚实的理论与技术基础｡参考文献:[1] 翟梅枝,高芳銮,沈建国,等. 抗TMV植物的筛选及提取条件对抗病毒物质活性的影响[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2004,32(7):45-49.[2] 吴艳兵,颜振敏,谢荔岩,等.天然抗烟草花叶病毒大分子物质研究进展[J].微生物学通报,2008,35(7):1096-1101.[3] 朱贤朝,王彦亭,王智发.中国烟草病害[M].北京:中国农业出版社,2002.[4] MCGRATH M T, SHISHKOFF N. 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烟草花叶病毒（TMV）的结晶及其化学本质的发现

烟草花叶病毒（TMV）的结晶及其化学本质的发现烟草花叶病毒⼀、温德尔·斯坦利⽣平简介温德尔·斯坦利（1904-1971），美国⽣物化学家，1904年8⽉16⽇⽣于美国印第安纳州。

曾任洛克菲勒医学研究院院⼠，加利福尼亚⼤学教授。

斯坦利所研究的是可⾃我复制却有似⼀种简单的化学物质的⽣物——病毒。

他的发现使⼈类了解⽣命的本质⼜向前跨进了⼀⼤步。

斯坦利推测认为，病毒可能是地球⽣命的第⼀种形式。

1935年，他使烟草花叶病毒（TMV）结晶，并证实此病毒是蛋⽩质及核酸分⼦聚集体⽽称为杆状结构。

这⼀发现可以利⽤X射线衍射⽅法来确切地查明多种病毒精细的分⼦结构及繁衍⽅式。

斯坦利还研究了流感病毒并研制了⼀种流感疫苗。

1946年，他因提纯并结晶了病毒，⽽且阐明了其分⼦结构⽽与诺斯罗普及萨姆纳共同获得了1946年诺贝尔化学奖。

斯坦利于1971年6⽉15⽇在西班⽛萨拉曼卡去世，享年67岁。

⼆、主要研究贡献1935年，温德尔·斯坦利（Stanley）发现烟草花叶病毒的侵染性能被胃蛋⽩酶破坏，在这⼀现象的启⽰下，他⼏乎磨了上吨重的感染花叶病的烟叶，企图⽤提酶的⽅法把病毒提纯出来。

他得到了⼀⼩匙在显微镜下看来是针状结晶的东西，把结晶物放在少量⽔中，⽔就出现乳光了，⽤⼿指沾⼀点这溶液，在健康烟叶上磨擦⼏下，⼀星期以后这棵烟草也得了同样类型的花叶病。

可见提纯的东西的确是有侵染性的烟草花叶病毒。

今天在美国加州⼤学的原来斯坦利实验室⾥，仍然保留着⼀个标注着“Tob. Mos.”字样的瓶⼦，其中就盛着当年第⼀次提纯的烟草花叶病毒（简称TMV）。

根据各种试验结果，证明这种结晶物质是蛋⽩质，初步的渗透压和扩散测定表明，这种蛋⽩质的分⼦量⾼达⼏百万。

其结晶制品的侵染性依赖于蛋⽩质的完整性，侵染性被认为是病毒蛋⽩质的⼀种性质。

Stanley 的研究论⽂1953年发表在Science杂志上，他在论⽂中写道：“烟草花叶病毒是⼀种具有⾃我催化能⼒的蛋⽩质，它的增殖需要活体细胞的存在”。

烟草花叶病毒重组实验

1.热点透析
2.典例剖析
3.规律方法
4.跟踪训练
5.真题演练
第六单元遗传的分子基础
烟草花叶病毒重组实验
汇报人姓名
一、热点透析
热点透析
甲
乙
该实验可以得出的结论是什么？
1.实验过程演示
甲病毒感染
乙病毒感染
重组病毒感染ຫໍສະໝຸດ 2.实验过程总结3.遗传物质的总结
(1)一切生物(朊病毒除外)的遗传物质是核酸(DNA或RNA)。 (2)凡细胞生物(不论是真核生物还是原核生物)，其遗传物质都是DNA，其细胞中的RNA只是遗传信息表达的媒介。 (3)DNA病毒如噬菌体的遗传物质是DNA，只有RNA病毒的遗传物质是RNA。
解析真核生物和原核生物的遗传物质都是DNA；细胞核和细胞质中的遗传物质都是DNA；甲型H1N1流感病毒属于RNA病毒，遗传物质是RNA。答案 C
2．科学家从烟草花叶病毒(TMV)中分离出a、b两个不同品系，它们感染植物产生的病斑形态不同。下列4组实验(见下表)中，不可能出现的结果是( ) A.实验① B．实验② C．实验③ D．实验④
孟德尔通过豌豆杂交实验发现了基因的分离定律和基因的自由组合定律；摩尔根通过果蝇的杂交实验证明了基因位于染色体上；DNA的X光衍射实验说明了DNA分子呈螺旋结构。证明DNA是遗传物质的实验有肺炎双球菌的转化实验和T2噬菌体侵染大肠杆菌实验。答案：C
不能确定是核酸在起作用。
解析
三、规律方法
规律方法
探索遗传物质的经典实验总结
生物的遗传物质
四、跟踪训练
跟踪训练
1．下列关于遗传物质的说法，错误的是( ) ①真核生物的遗传物质是DNA ②原核生物的遗传物质是RNA ③细胞核的遗传物质是DNA ④细胞质的遗传物质是RNA ⑤甲型H1N1流感病毒的遗传物质是DNA或RNA A．①②③ B．②③④ C．②④⑤ D．③④⑤

烟草花叶病毒的检测方法研究进展

Ｋｅｙｗｏｒｄｓｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｒｅｇｓｓ
烟草花叶病毒（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）是一种ＲＮＡ
ＡｂｓｔｒａｃｔＴｏｂａｃｃｏＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ（ＴＭＶ）ｈａｓａｗｉｄｅｒａｎｇｅｏｆｈｏｓｔ，ａｎｄｉｔｃｏｕｌｄｂｉｒｎｇｇｒｅａｔｌｏｓｓｔｏａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｔｈａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔ
长３００ｎｍ、直径１８ｎｍ的圆柱形结构，其中心含有１个约４ｎｍ的沟槽。该病毒蛋白外壳围绕１个约６４００个核苷酸
的单股ＲＮＡ形成。围绕单股ＲＮＡ的蛋白亚基具有螺旋形
ｓｈｏｕｌｄｃｏｍｂｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｔｏｉｅｐｒｒｏｖｅｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
ｓｉｇｎｉｉｆｃｎｃａｅｉｎｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｒｅｖｉｅｗｉｎｇｒｅｃｅｎｔｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ．ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｓｕｃｈａｓｄｉｒｅｃｔｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｒｏｌｏｙｇａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｗｉｔｈｔｈｅ

文献综述1

烟草花叶病毒防治研究综述摘要：烟草花叶病毒( tobacco mosaic virus, TMV) 是一种植物正单链RNA病毒,可侵染38 个科268 种植物[1]。

烟草花叶病是由多种病毒引起的一类世界性重要病害, 一般年份减产20%至30%,流行年份则毁种甚至绝收, 严重影响了烟叶产量和质量, 挫伤了烟农的生产积极性。

烟株感染花叶病后，烤晒后颜色不均，烟叶品质变劣、等级下降，极大地影响烟农的经济效益。

因此, 控制烟草花叶病的危害已成为当前烟草生产中急需解决的问题。

针对烟草花叶病的防治, 国内外一些学者已作了许多研究, 但都仅针对某一种病毒或病害的某个方面。

因此, 根据目前的研究进展, 探索一套经济、合理和有效的防治方法是十分必要的。

本文综述了国内外对烟草花叶病防治技术的研究现状及存在问题。

关键字：烟草花叶病毒；育种；防治；1 研究现状人们对烟草花叶病毒（Tabacco mosaic virus,TMV）的研究已经一个多世纪了，TMV是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的代表种，其寄主范围非常广泛，TMV除危害烟草外，还能侵染番茄、茄子、马铃薯、辣椒、龙葵等茄科植物[2]。

目前，还没有开发出很好的抗病毒药剂，为了寻找较好的防治植物病毒病的资源，人们进行了多方面的探索和研究。

1.1 抗植物病毒育种选育抗病品种是预防烟草花叶病最经济有效的措施。

为了寻找优良的抗病品种或抗源,国内外育种工作者进行了大量的研究。

早在40-50 年代, 美国等国家就育成了抗烟草普通花叶病( TMV ) 的品系( Ky56、Ky57 ) 。

自Holmes 等( 1960 ) 开始抗烟草黄瓜花叶病( CMV) 育种以来, 各地已选育出一些抗( 耐) 病品种或抗源。

陈振华等( 1989) 成功选育出3 个对CMV 耐病性较强的品系; 戴冕等育成3 个高耐CMV 品系, 其中1 个品系兼抗TMV[3]。

传统的抗病育种时间较长, 也很难筛选出优质高抗基因。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。

天然产物抗烟草花叶病毒(TMV)研究进展

Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｔｈｓｐａｒｓｍｍａｉｅｈｎｉ— ＴＭＶｆｅｔｆｎｔｒｌｐｒｄｕｔｒｍａｔｉｐｅｕｒｚｄｔｅａｔｅｆｃｓｏａｕａｏｃｓｆｏｐｌｎｓ。ｍｉｒｏｇｎｓｃｏｒａｉｍｓ，ａｉｌｎａｉｅａ．ｎｍａｓａｄｍｒｎ１ｇａ．ａｒｓｃｅｈｏｔｏｆＴＭＶｙｕｉｇｖｒｏｔｒｌｐｒｄｕｔｎｐｏｕｃｉｎｐｒｃｉｅｎｄｐｏｐｅｔｄｔｅｃｎｒｌｏｂｓｎａｕｓｎａｕａｏｃｓｉｒｄｔｏａｔｃ．ｉ
随着人们对生态、健康和安全等问题的Ｅｔ益重视，化学农药、转基因等手段在生产中的使用正受到一定的限制，而
利用天然产物防治烟草花叶病逐渐成为新的研究
执占：
可逆的抑制，具有广谱抗植物病毒活性。核糖体失活蛋白广泛存在于高等植物体内，迄今为止已在大戟科、忍
抗性。
１植物源类抗烟草花叶病毒物质
根据现有研究结果，物源活性物质抗烟草花叶病植
２ｏａｃｃｅｃｅｅｒｈＩｓｔｔ．ＣｅｚｏｏａｃｏａｙｏｎｎＰｏｉｃ．ＴｂｃｏＳｉｎｅＲｓａｃｎｔｕｅｈｎｈｕＴｂｃｏＣｍｐｎｆＨｕａｒｖｎｅ，Ｃｅｚｏ２００，Ｃｉａｉｈｎｈｕ４３０ｈｎ）
摘叶病毒（ＭＶ）Ｔ的效果，并对在生产实践中利用不同来
源的天然产物防治烟草花叶病毒病进行了展望。

烟草花叶病毒的发现、揭示和生物学意义

2014年第49卷第12期’生物学通报55烟草花叶病毒的发现、揭示和生物学意义任衍钢宋玉奇白冠军卫红萍(阳泉师范高等专科学校山西阳泉045200)摘要烟草花叶病毒(TMv)研究在生命科学中具有标志性作用。

用TMV作为实验材料，发现RNA也具有遗传功能，在化学因素的作用下也能发生基因突变。

依据TMV的x射线衍射图像对TMV进行分子结构的建模工作，利用TMV的外壳蛋白基因获得了首例转基因抗病毒植株，证明了病原体能引发抗性的观点。

关键词TMV发现揭示意义中国图书分类号：Q一1文献标识码：E在科学研究中，实验材料是影响学科发展的关发现、揭示和生物学意义作简要的历史回顾。

键因素之一。

在病毒学领域的实验材料中，烟草花叶1TMV的发现和鉴定病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)具有标志性的作TMV是烟草花叶病毒属的代表种，该病毒之用。

TMV是人类最早发现、最早提纯和结晶、最早利所以能引起重视，与烟草这种当时迅速发展的经济用超速离心机和电泳设备检测。

以及最早在电子显作物有关，TMV的侵染能使烟草减产达30％一50％微镜下观测到的病毒；其RNA最早被证明携带有遗之多。

1886年，在荷兰工作的德国农业化学家麦尔传信息并具有侵染性，TMV外壳蛋白(CP)的氨基(Adolf Mayer)最早研究了导致烟草花叶病的原因。

酸排列顺序最早被测定并发现其能实现自我组装；麦尔把烟草花叶病株的汁液注射到健康烟草的叶 TMV是最早利用病毒CP被作为抗性转基因植株的脉中，健康烟草也感染了烟草花叶病，由此他认为，介导物，最早被证明编码运动蛋白(MP)的病毒。

烟草花叶病是一种植物传染病。

但不是无机物平衡TMV在病毒研究中具有重要地位，本文对TMV的失调所导致的营养病，而是一种细菌病。

1892年，40．袋鼹(Notoryctemorphia目)栖息于南澳、西澳和 5 45l、、．m 500 3‘i～i—j—j北疆沙漠，它们穴居于沙中，并将身后的隧道封住，Echymipera TATGCTATTGCATGTCGACACAGTAT—ATGATCGACCATCAAACACTACT造成一种在沙中“游泳”的表象。

烟草花叶病毒的实验

关于烟草花叶病毒的实验
教学问题：烟草花叶病毒的实验教材上介绍很简单，本人查阅了梁红主编的《遗传学》，稍了解了此实验的过程。
1956年，美国学者弗伦克尔一库兰特（Fraemkel-Courat）用烟草花叶病毒（TMV）的重建实验证明了RNA也是遗传的物质。
这实验是用烟草花叶病毒进行的。TMV是一种RNA病毒，它有一圆筒状的蛋白质外壳，由很多相同的蛋白质亚基组成；内有一单链RNA分子，沿着内壁在蛋白质亚基间盘旋着。那么，在这种RNA病毒中遗传信息在RNA上，还是在蛋白质呢？
一、感染实验
把TMV在水和苯酚中震荡，把病毒的RNA和蛋白质分开，分别去感染烟草，单是病毒的蛋白质，不能使烟草感染，单是病毒的RNA，可以使烟草感染，病毒RNA进入叶子细胞，进行繁殖，产生正常的病毒后裔。单是RNA感染效率很差，可能因为RNA裸露，在感染过程中容易被酶所降解。用RNA酶处理RNA很多株系，他们可以根据寄主植物不同和在寄主植物中地片上形成一病斑的差异来加以区别。例如有两株系，它们的外壳蛋白就不同：S株系的外壳蛋白不是具有组氨酸和甲硫氨酸，而HR株系含有这两种氨基酸。
弗伦克尔－库兰特利用分离而后聚合的方法先取得S株系的蛋白质外壳和HR株系的RNA，然后把它们结合起来，形成杂种病毒，有着S株系的外壳，可被抗体所失活，但不受对HR株系制备的抗体所影响，当杂种病毒用来感染烟草时，病斑总是跟RNA授体的病斑一样，所以显而易见，第二代病毒颗粒具有HR株系的RNA和HR株系的蛋白质外壳。把HR株蛋白质和S株系的RNA结合起来，形成杂种病毒。把重建的病毒来感染烟草也得到了类似的结果。所以我们可以这样说，在不含有DNA的病毒中，复制和形成新病毒的颗粒所必需的遗传信息是携带在RNA上。

烟草花叶病与病毒的发现

烟草花叶病与病毒的发现
谈起病毒的发现，首先要提到的就是烟草花叶病毒。

烟草花叶病毒在病毒学发展史乃至遗传学、生物化学以及当代基因工程中起到了里程碑的作用。

它使人们了解到什么是病毒、病毒的结构、病毒的侵染、复制以及抗病毒基因工程等等。

1886年，在荷兰工作的德国人麦尔把患有花叶病的烟草植株的叶片加水研碎，取其汁液注射到健康烟草的叶脉中，能引起花叶病，证明这种病是可以传染的。

通过对叶子和土壤的分析，麦尔指出烟草花叶病是由细菌引起的。

1892年，俄国的伊万诺夫斯基重复了麦尔的试验，证实了麦尔所看到的现象，而且进一步发现，患病烟草植株的叶片汁液，通过细菌过滤器后，还能引发健康的烟草植株发生花叶病。

可是他并没有意识到这一现象的重要意义，反而抱怨他用的过滤器出了毛病。

这也难怪, 因为他生活在巴斯德细菌致病说的极盛时代，没有足够的勇气冲破思想上的无形禁区。

1898年，荷兰细菌学家贝杰林克同样证实了麦尔的观察结果，并同伊万诺夫斯基一样，发现烟草花叶病病原能够通过细菌过滤器。

但贝杰林克想得更深入。

他把烟草花叶病株的汁液置于琼脂凝胶块的表面，发现细菌在凝胶中以适度的速度扩散，而感染烟草花叶病的物质仍滞留于琼脂的表面。

从这些实验结果，贝杰林克指出，引起烟草花叶病的致病因子有三个特点：1.能通过细菌过滤器；2.仅能在感染的细胞内繁殖；3.在体外非生命物质中不能生长。

根据这几个特点他提出这种致病因子不是细菌，而是一种新的物质，称为“有感染性的活的流质”，并取名为病毒，拉丁名叫“Virus”。

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究钱玉梅;王凤龙;陈德鑫;张连涛;赵黎明;周显声【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2004(010)004【摘要】对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出.卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病.【总页数】5页(P15-19)【作者】钱玉梅;王凤龙;陈德鑫;张连涛;赵黎明;周显声【作者单位】中国农业科学院烟草研究所,中国烟草总公司青州烟草研究所,山东青州,262500;中国农业科学院烟草研究所,中国烟草总公司青州烟草研究所,山东青州,262500;中国农业科学院烟草研究所,中国烟草总公司青州烟草研究所,山东青州,262500;中国农业科学院烟草研究所,中国烟草总公司青州烟草研究所,山东青州,262500;中国农业科学院烟草研究所,中国烟草总公司青州烟草研究所,山东青州,262500;将军集团济南卷烟厂技术中心,山东济南,250100【正文语种】中文【中图分类】S432.41【相关文献】1.植物提取物抑制烟草花叶病毒(TMV)的研究进展 [J], 韩锦峰;王晓军;刘华山;白海群;陈秀华2.天然产物抗烟草花叶病毒(TMV)研究进展 [J], 杨爱娟;李宏光;谭济才;鲍政;张勤3.枯草芽孢杆菌Tpb55抗烟草普通花叶病毒(TMV)活性研究 [J], 张成省;孔凡玉;刘朝科;王秀芳4.菌克毒克防治烟草普通花叶病毒(TMV)及对病程相关蛋白的诱导作用研究 [J], 杜春梅;李浩戈;赵秀香;吴元华;贝纳新5.抗马铃薯Y病毒(PVY)和烟草花叶病毒(TMV)单联弱毒疫苗的研制及防效测定[J], 姜瀚林; 孟凡武; 田延平; 郭兆奎; 刘永中; 万秀清; 刘文涛; 李现道; 李向东; 张永春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。