果实成熟的基因工程研究

果实成熟的基因工程研究朱广廉（北京大学生物学系北京100871）摘要乙烯是催化果实成熟的内源植物激素。

本文简要介绍用植物基因工程的手段分离和鉴定出与乙烯合成和果实成熟有关的多聚半乳糖醛酸酶、ACC氧化酶、ACC合酶及ACC脱氨酶的基因。

并利用反意RNA技术将它们的反意RNA转入番茄中，得到了相应的反意转基因植株和果实，实现了在基因水平上对果实成熟的调控，开辟了植物育种的新途径。

关键词果实成熟乙烯植物基因工程番茄聚半乳糖醛酸酶植物学家和植物生理学家早期的研究认为：聚半乳糖醛酸酶（PG）与果实的软化和成熟有关；乙烯能促进果实成熟，并把它视为果实成熟激素。

1979年杨祥发及其合作者阐明了乙烯生物合成的途径，其主要步骤是：Met (1) SAM (2)、ACC (3) 乙烯从上面的反应步骤看出，乙烯合成的前体是蛋氨酸（Met）,直接前体是1-氨基环丙烷基羧酸（ACC）。

这三步反应分别由腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶（1），ACC合酶（2）和乙烯形成酶（EFF，又称ACC氧化酶）（3）所催化，其中ACC合酶是乙烯合成的限速酶。

在此基础上，科学家们开始了用基因工程的手段研究PG和乙烯在果实成熟中的作用及对果实成熟的调控。

下面就这两方面的研究作简单的介绍。

1.PG与果实软化和成熟的关系1.1生理生化的研究结果植物解剖学家和生物化学家研究的结果表明,在末成熟果实的细胞初生壁和中胶层中都充满着果胶,它与细胞壁中的纤维素和半纤维素分子结合,将细胞粘连在一起,由此认为,果实的硬度是由于果胶的交联作用。

生物化学的分析表明，果胶是由原果胶、果胶酸甲酯和果胶酸组成，三种成分的基本结构都是聚半乳糖醛酸，即果胶酸。

果胶酸是由半乳糖醛酸通过1,4-糖苷键连接起来的链状化合物，PG可将它水解成半乳糖醛酸。

在果实成熟中，原果胶酶和果胶酶的活性增强，原果胶酶将不溶于水的原果胶分解成可溶性果胶酸，PG将可溶性果胶酸水解成半乳糖醛酸，于是认为是由于PG的作用导致了果肉细胞的彼此分离，使果实软化。

这一观点的较直接证据有二：其一是PG定位于细胞的中胶层中，其酶蛋白构成细胞壁蛋白的主要成分，在PG高峰时可达到细胞总蛋白的4%～5%，当果实软化时，伴随有PG活性的增强，可溶性果胶相应增加，果胶链的长度相应缩短；其二是，用纯化的PG处理未成熟的果实，可以使果实的细胞溶解，并有果胶和半乳糖醛从细胞壁中析出，这种变化与果实成熟时的变化一致。

由此认为PG是果实软化的主要酶，并认为PG与果实的成熟密切相关。

又由于乙烯能诱导跃变型果实呼吸的跃变，并伴随有PG活性的升高，于是认为乙烯诱导了PG水平的升高，进而导致了果实的成熟。

此外，人们还曾认为果实的成熟是由于果实细胞内区域化结构受到破坏，从而活化并释放出许多水解酶类，其中包括PG，它们参与了与果实成熟有关的代谢。

1.2植物基因工程的研究近年来，分子生物学的发展改变了人们对PG与果实成熟和乙烯关系的认识。

科学家们已测定了PG基因的全序列，通过对PG基因克隆的研究，证明了编码PG的基因只有1个，它位于第10染色体上，1988年布赖德特尔（Bridetal）等对PG基因进行了研究，在PG基因转录位点前1450pb片段的非编码区，连上Cat（编码氯酶素乙酰转移酶）报道基因，并将它们转入番茄中，发现PG-Cat嵌合基因只在成熟的果实中表达，在果实发育的其他阶段及其他组织中都不表达。

这一结果说明果实中PG基因的表达具有时、空间的特性，是受发育信号调控的。

PG不是由于细胞内区域化受到破坏而被激活和释放的，是受发育信号调节的基因表达的结果。

1988年史密斯（Smith）等利用反义（antisense）RNA技术，将PG的cDNA反向插入植物表达载体CaMV35s启动子，之后转入番茄中，获得PG缺陷型植株，试图研究PG的功能和在果实软化及成熟中的作用。

他们将获得的转基因植株进行自交，得到含有2、1和0个反义PG基因拷贝的植株，发现这些植株的果实中，PG活性和果胶的降解分别为对照的1%、10%和100%，活性的降低在果实成熟过程中是稳定的，可遗传的，并且PG的活性依赖于基因的剂量。

他们还进一步观察了PG水平的下降对果实软化和成熟的影响，发现在含有两个拷贝的反义PG基因的果实中，虽然反义基因严重抑制了PG的活性和果胶的降解（为对照的1%），但反义PG基因并没有像预期的那样能推迟果实的软化或软化程度，也没阻止果实成熟的进程和改变果实成熟过程中的其他特征，如番茄红素和乙烯的合成，蔗糖和果胶酯酶的活性，果实仍能正常成熟。

这一结果有力地说明果实的成熟是一个复杂的生理过程，PG不是决定果实软化和成熟的关键性酶。

后来焦万诺尼（Giovannoni）等人将PG基因接在一个可被乙烯或丙烯诱导的启动子之后，转入果实成熟缺陷的番茄突变株中，在PG活性被乙烯诱导后，果实中果胶的溶解增加，但果实不能软化。

这一结果再次证明了PG不是果实软化的关键性酶。

关于PG与乙烯的关系，在ACC合酶反义基因的番茄中观察到，当ACC合酶和乙烯的产生被反义基因抑制时，PG的活性不被抑制，说明PG的表达是不依赖于乙烯的。

有人推测乙烯可能调节PGmRNA的翻译。

上述基因工程研究的结果说明，PG的功能是降解果胶酸。

PG不能引起果实的软化，果实的软化是复杂的，是受果实的发育信号所调控的。

推测，果实的软化与所有参与降解细胞壁的酶有关，包括原果胶酶、果胶酸酯酶、纤维素酶和半纤维素酶。

PG不是人们过去所认为的是果实软化和成熟的关键性酶。

2.乙烯与果实成熟的关系2.1用反义RNA控制乙烯生成的研究在DNA双链中，可作为mRNA转录模板的链称为有意义链，与它配对的不转录的另一条链即为反意义链，反义链对应的RNA称为反义RNA，它与mRNA互补。

反义RNA可抑制mRNA的表达。

1990年汉密尔顿（Hamilton）等用反义RNA技术获得乙烯形成酶反义基因的番茄转化植株，发现纯合的乙烯形成酶反义基因番茄果实中，乙烯的合成被抑制达97%，果实的着色时间同正常果实相同，但红色变淡。

贮藏实验表明它比正常果实更耐过熟及皱缩。

1991年Oeller等将乙烯合成的限速酶ACC合酶的反义基因导入到番茄植株中，反义基因几乎完全控制了ACC合酶的转录，在纯合的转基因果实中。

乙烯合成的99.5%被抑制，乙烯的释放水平低于0.1nl/g.hr，果实不能正常成熟。

正常果实于授粉后50天左右即产生成熟乙烯，60天左右可完全成熟，而反义ACC合酶转基因果实，在大气中或植株上保存90~120天，只产生桔黄色，但不能变红、变软和产生香气。

此外，反义基因果实在大气中没有呼吸高峰出现。

当用外源处理时，发现乙烯可逆转ACC合酶反基因植株的表型，并诱导出正常的果实呼吸高峰及成熟过程。

经乙烯处理的果实与自然成熟的果实在质地、颜色、芳香气味和可压缩性方面均没有区别。

他们还发现用乙烯处理反义果实1~2天，不能诱导完全成熟的表型，需连续处理6天以上，反义果实才能正常成熟。

这一结果说明乙烯诱导的果实成熟过程需要相关基因的连续表达，处理1~2天是不够的，这暗示乙烯诱导的mRNAs或多肽具有较短的半衰期。

2.2通过导入外源基因抑制乙烯的产生1991年Klee等将假单胞菌中存在的能催化ACC分解的ACC脱氨酶基因导入番茄，通过该基因表达的产物催化ACC脱氨来抑制乙烯的产生。

他们是将ACC脱氨酶基因接在CaMV35s启动子之后，然后通过农杆菌导入番茄的。

该基因在番茄中得到了超表达，果实成熟过程中，乙烯合成的90%~97%被抑制。

转基因植株的营养型无明显的变化，可以正常开花、结果、种子正常成熟、萌发，但果实的成熟明显推迟，在室温下贮存6周后果实的硬度与新采收的基本相同。

3. PG和乙烯与果实成熟关系的新观点近年来，调节果实成熟的基因工程研究的结果归纳如下：1）PG不是调节果实软化和成熟的关键性酶，果实的软化可能与降解细胞壁的所有酶有关；2）PG基因在果实成熟过程中不受乙烯的诱导，对它的诱导来源于比乙烯更早的成熟信号，推测乙烯是通过控制PG mRDA的翻译或PG多肽的稳定性调节PG合成；3）乙烯是诱导果实成熟的激素，是果实成熟和衰老过程中关键性调节分子；4)杨氏环（Y ang，s Cycle）是果实成熟中乙烯合成的唯一途径；5）乙烯介导的果实成熟过程需要有关基因（ACC合酶）的连续转录，说明被诱导的基因产物半衰期短；6）在乙烯介导的果实成熟中乙烯不只是起一个开关的作用，它还有剂量效应，在果实成熟的过程中都需要高水平的乙烯来维持；7）在番茄果实成熟过程中，至少存在两个信号传导途径，一个是依赖于乙烯的途径，它激活一些基因的转录及转录后的调节，如番茄红素和芳香物质的合成，呼吸代谢的加速，ACC 合酶基因的表达及受发育信号调节转录的PGmRNA的翻译；另一个是不依赖于乙烯（或称发育）的途径，它负责的有PG、ACC氧化酶和叶绿素合成等酶的转录、激活。

总之，果实的成熟是一个复杂的发育过程，是由一系列基因相继活化而控制的，但乙烯是果实成熟过程中调节表达的最重要、更直接的分子。

4.展望用基因工程的方法将ACC合酶和ACC氧化酶的反义基因和外源的ACC脱氨酶基因导入正常植株中，获得乙烯合成缺陷型植株，达到控制果实成熟的目的，已在番茄中实现。

这一成就已被迅速推广到其它果实成熟的调控中，如；转基因的芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉和桔子等水果中。

这些技术必将发展成为调控果实成熟和衰老的普遍技术，为水果的贮藏保鲜带来一次革命。

但这一技术将可能得到进一步的改进和完善，如将反义基因接在可调控的启动子之后再转入植株，这样就可以通过改变植物的内外部条件控制反义基因的开和关。

当想使某种果实推迟成熟时，就启动反义基因的表达，阻止乙烯产生；当需要果实成熟时就可以改变某种条件，关闭反义基因，于是乙烯合成，果实发育成熟。

再如，通过同源重组技术获得不泄漏（nonleaky）的成熟突变体，获得完全不产生乙烯的果实，这样的果实会具有长期的贮藏保鲜能力。

资料来源：《生物学通报》1995年第30卷第11期。