石蜡包埋切片制作法
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程一、石蜡包埋:1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。
（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。
70%的酒精可作为更久的保存剂。
）2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min.二甲苯（组织透明即可停止) 15min.50%二甲苯+50%石蜡20-30min.纯石蜡1 45min.纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。
）3.包埋：a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。
b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。
等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。
c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。
d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑）e.固着蜡块二、切片1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油）2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。
将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。
接着将载玻片放在37℃上烘烤。
常见问题分析：1.切片分离不能形成蜡带：☞室温过低，蜡过硬。
2.蜡带弯曲：☞蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。
3.切片厚薄不一: ☞切片刀或蜡块未固定紧。
4.切成片后，组织与蜡块脱离：☞脱水不干净等。
5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：☞室温太高或蜡太软或刀的角度太小。
6.切片破裂：☞浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
石蜡切片法透明透蜡包埋
附：植物材料的透蜡过程必须缓慢进行，所须的时间 约需1-2天。其方法如下：①将材料连同二甲苯一起倒 入小蜡杯中；②然后轻轻倒入溶解的石蜡。石蜡就在二 甲苯的上层凝固起来。此时可将小蜡杯放在35-37ºC温箱 内，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需1-2天；③将蜡杯 移入56-60ºC温箱中，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的 石蜡，以后每隔1小时左右更换已熔的纯蜡一次，共换纯 蜡2-3次即可进行包埋。
二、试剂与器Βιβλιοθήκη 1.试 剂：1/2 无水乙醇+1/2二甲苯、 二甲苯、 1/2二甲苯+1/2石蜡、 纯石蜡。 2.器 材：恒温箱、蜡杯、镊子、解剖针、 酒精灯、塑料面盆、温台。
三、实验程序
1．透明：透明也是渐次由低浓度至高浓度。材料先 在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转 入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
五、思考题 1 .当材料周围出现白色雾状时，应退回纯酒精中重
新脱水。为什么？
3．包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料 平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提 起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟）后即 可取出备用。
四、注意事项
透明的注意事项 • 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水分进入； • 更换透明剂，动作要迅速； • 材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。 透蜡的注意事项 • 动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。 • 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 包埋的注意事项 • 包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。 • 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
组织石蜡包埋和切片技术
组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。
所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。
一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
石蜡包埋技术实验报告
一、实验目的1. 掌握石蜡包埋技术的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉石蜡包埋在组织切片制作过程中的重要作用。
3. 了解石蜡包埋技术在病理诊断、科研等领域的应用。
二、实验原理石蜡包埋技术是一种常用的组织切片制备方法，其基本原理是将组织固定、脱水、透明、浸蜡后，将其包埋在石蜡中，形成硬化的组织块，便于后续的切片和染色等操作。
石蜡具有较好的透明度和可塑性，且与组织切片易于分离，有利于显微镜观察。
三、实验材料1. 新鲜组织样本：如肿瘤组织、正常组织等。
2. 固定液：4%多聚甲醛溶液。
3. 脱水剂：75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II、醇苯、二甲苯I、二甲苯II、蜡I、蜡II、蜡III。
4. 包埋剂：石蜡。
5. 切片机：石蜡切片机。
6. 其他：手术刀、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、烘箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 组织固定：将新鲜组织样本放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上。
2. 取材：将固定好的组织从固定液中取出，用手术刀将目的部位组织修平整，并切取适当大小的组织块。
3. 脱水：将组织块依次放入75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中，每个酒精浓度处理1小时。
4. 透明：将组织块放入醇苯中处理5-10分钟，再放入二甲苯I中处理5-10分钟，最后放入二甲苯II中处理5-10分钟。
5. 浸蜡：将组织块放入石蜡I中处理1小时，再放入石蜡II中处理1小时，最后放入石蜡III中处理1小时。
6. 包埋：将浸好蜡的组织块放入包埋模具中，待蜡凝固后取出，修整蜡块。
7. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上，切片厚度约为4微米。
8. 摊片：将切片漂浮于摊片机40℃温水上，将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。
9. 脱蜡：将烤干的切片依次放入二甲苯30分钟、无水乙醇10分钟、95%酒精5分钟、90%酒精5分钟、80%酒精中处理。
10. 染色：将脱蜡后的切片进行HE染色或其他染色。
石蜡包埋步骤
心肌组织石蜡包埋与切片
多聚甲醛配制：
1×PBS + 4%多聚甲醛（PH值7.2-7.4）
1×PBS：Na
2HPO
4
.12H
2
O 2.88g
NaH
2PO
4
.2H
2
O 0.296g
NaCl 8.5g
定容至1L。
熔蜡过程：
新蜡块最好提前放入烤箱，反复凝熔3次以上，再做浸蜡包埋。
1)大鼠心室经4%多聚甲醛固定24h以上，将组织放入包埋框内，用铅笔做
好标记；
2)将包埋框与组织一起放入0.01M PBS，震荡冲洗30min×2次；
3) 弃去PBS，心脏组织经乙醇梯度脱水：75%乙醇4h，80%乙醇4h，95%乙醇Ⅰ2h，95%乙醇Ⅱ2h，100%乙醇Ⅰ1h 20min，100%乙醇Ⅱ1h 40min；
4) 二甲苯透明：二甲苯：乙醇（1:1）10min，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min；
5) 浸蜡：石蜡Ⅰ40min，石蜡Ⅱ2h；石蜡I、石蜡II与包埋蜡反复凝固融化3次，浸蜡时温度控制在56-60 ℃。
6) 石蜡包埋：将熔化的石蜡（注意保持石蜡密度的均一性）倒入包埋框，用加热的镊子将浸蜡后的组织块放入包埋框内，温度控制在56-60℃（整个操作过程尽可能快），待石蜡凝固后取下石蜡块准备切片；
7) 切片：每个标本取10张切片，切片厚度为5μm左右。
将切片铺于预先用多聚赖氨酸包被的载玻片上，60℃置于烤片机中烘烤60min。
染色前将切片置于37℃烤箱中过夜或60℃ 2h。
《病理检验技术》课件——石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
7.若天气太冷，切片时组织蜡片容易碎裂，对着组织蜡块面 呵一口气后进行切片，可改善组织蜡片容易碎裂的情况，但 所切出的第一、二张组织蜡片厚度会比原来设定的切片厚度 稍厚一些，因此，前一、二张切出的组织蜡片不要。
石蜡包埋组织切片
6.调节切片刀的切片角度：切片机刀座上都有标 示切片刀切片角度的刻度，切片前需调节切片刀 至合适的切片角度，才能切好片。通常切片机上 刀座刻度范围为0°～10°，一般设定切片刀的 角度在8°左右为宜。但真正的切片角度是余隙 角。 所谓余隙角是指切片刀下刀锋倾斜面与组织蜡块 面的夹角。余隙角避免了切片时切片刀往返过程 中刀与组织蜡块面之间的摩擦。最理想的余隙角 是2°～4°，太大或太小都不能切好片。
3.如用金属框包埋组织蜡块，必须把四边修整平行，否 则在切片时会切出弯曲的组织蜡片带。
4.切片用毛笔应选用松软毛的水彩画笔，清扫切片刀上 的蜡屑时应顺着刀背往刀锋扫，避免刀锋切割笔毛，损 坏刀锋。
石蜡包埋组织切片
5.切片时转动切片手轮或推拉切片刀的动作要轻， 用力均匀。若用力太猛和速度太快，将会引起切片 压缩，也易导致轮转式切片机齿轮的磨损。
病理检验技术
石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
组织石蜡切片 石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
送检组织经过固定、 脱水、透明、浸蜡和 石蜡包埋制成组织蜡 块后即可马上进行切 片，称石蜡包埋组织 切片，简称石蜡切片。
石蜡包埋组织切片
一、石蜡切片操作过程
1.组织蜡块排序、冷冻：按病理号排序，先切在 前；蜡块组织面朝下放在一盘平整的冰块或冷冻 台上冷冻（-4～0℃）几分种后开始切片。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
石蜡包埋组织切片制作过程
石蜡包埋组织切片制作过程石蜡包埋组织切片制作是组织学研究中常用的一种技术，它可以将组织样本固定、包埋、切片、染色等一系列步骤完成，以便于观察和分析组织结构和功能。
下面将详细介绍石蜡包埋组织切片制作的过程。
1. 组织固定需要将待研究的组织样本进行固定，以保持其形态和结构。
常用的固定剂有福尔马林、乙醛、甲醛等。
固定时间和温度根据不同的组织类型和固定剂而异，一般需要固定4-24小时。
2. 组织脱水固定后的组织需要进行脱水处理，以去除其中的水分，使其能够与石蜡相容。
脱水一般采用乙醇逐渐升级浓度的方法，如70%、80%、95%、100%乙醇，每个浓度的时间一般为1-2小时。
3. 组织清洁脱水后的组织需要进行清洁处理，以去除其中的脂肪和其他杂质。
清洁一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。
4. 组织浸渍清洁后的组织需要进行浸渍处理，以使其与石蜡相容。
浸渍一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。
5. 组织包埋浸渍后的组织需要进行包埋处理，以使其能够被切片机切割。
包埋一般采用石蜡，将组织样本浸泡在石蜡中，然后在石蜡中进行固化。
固化时间和温度根据不同的组织类型和石蜡而异，一般需要固化4-24小时。
6. 组织切片包埋后的组织需要进行切片处理，以便于观察和分析组织结构和功能。
切片一般采用微型切片机，将石蜡包埋的组织样本切成薄片，厚度一般为4-6微米。
7. 组织染色切片后的组织需要进行染色处理，以便于观察和分析组织结构和功能。
常用的染色剂有血液学染色剂、组织学染色剂等。
染色时间和方法根据不同的染色剂而异，一般需要染色5-30分钟。
石蜡包埋组织切片制作过程是一个复杂的过程，需要进行多个步骤的处理，以保证组织样本的完整性和可观察性。
这种技术在组织学研究中具有重要的应用价值，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。
石蜡包埋切片制作法
一、制备显微标本的切片法一石蜡包埋切片制作法这是最常用的切片法。
以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。
用切片机制取极薄的切片。
为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。
过程大致如下：⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。
因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。
凡供永久保存的标本都需经固定处理。
常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。
还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。
⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。
通常用乙醇（Alcohol，酒精），浓度递升到100%。
此过程还使组织块进一步硬化。
⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。
通常用二甲苯（xylene）为透明剂。
⑷浸蜡：在温箱内进行。
已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。
⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。
⑹切片：用切片机。
常用的切片机有轮转式、平推式的。
用轮转式的易于切出连续切片。
切片厚度随制片目的而调整。
教学标本厚度多是5~6μm。
⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。
染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。
二冷冻切片法冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。
冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。
恒冷切片机是高级冷冻切片设备。
它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。
恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。
切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。
冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。
SOP-BL-01-02 常规石蜡包埋组织制片(常规切片)的制备
四川友谊医院常规石蜡包埋组织制片制备标准操作流程1)制备程序1．水洗。
2．脱水。
3．透明。
4．浸蜡。
5．包埋。
6．切片。
2)注意事项组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m 以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。
3)常规切片的手工操作1．水洗用流水冲洗已经固定的组织块30min。
2．脱水(常温下)(1)乙醇—甲醛(AF)液固定：60～120min。
(2)80％乙醇：60～120min。
(3)95％乙醇I：60～120min。
(4)95％乙醇Ⅱ：60～120min。
(5)无水乙醇I：30～60min。
(6)无水乙醇Ⅱ：30～60min。
(7)无水乙醇Ⅲ：30～60min。
注意事项：①未经充分固定的组织不得进入脱水程序；②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～l0倍以上；③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水；④脱水试剂应及时过滤、更换(500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换)；⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水；⑥组织块置于无水乙醇内的时间不宜过长(以免硬化)；⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。
3．透明(1)二甲苯I：20min。
(2)二甲苯Ⅱ：20min。
(3)二甲苯Ⅲ：20min。
注意事项：①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长(以防组织硬、脆)，并依不同种类组织及其大小而异(组织块呈现棕黄或暗红色透明即可)；③二甲苯应及时过滤、更换；④组织块经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4．浸蜡(1)石蜡工(45～50℃)：60min。
(2)石蜡Ⅱ(56～58℃)：60min。
(3)石蜡Ⅲ(56～58℃)：60min。
注意事项：①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中(70℃)进行，不得用明火加温；②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带人熔蜡中；④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分(组织过软)，过长时组织硬脆；⑤熔蜡应及时过滤、更换。
石蜡包埋切片方法
石蜡切片基本步骤之一器材和试剂一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7&asymp H7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8&asymp H6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml; 蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml ;蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~50px厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛: 多聚甲醛8g;蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
1N NaOHlN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量氧化钠(NaOH )；分子量＝40．005，当量价＝11N Na0H的配制方法为：m＝40．005／1＝40．005g。
快速石蜡包埋组织切片的制备
快速石蜡包埋组织切片的制备㈠煮沸固定切片法1．固定：切取大小适宜（厚度<2mm）的组织块，尽快置入装有5~8ml 10%中性4％甲醛的试管中煮沸1min，然后已入冷水中。
2．脱水（1）将已经煮沸固定的组织块取出，用刀片将其厚度修切至<1.5mm，随即置入盛有5~8 ml丙酮的试管中，煮沸2 min，然后将丙酮倾弃。
（2）再向该试管中重新加入5~8 ml丙酮并煮沸2min。
如此重复3~4次。
3．浸蜡：将已经丙酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液体，随即置入75~80℃熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时（约需30s），即可包埋。
4．包埋、切片和染色。
（1）用热镊子将预制的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。
（2）待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使蜡块表面平整。
（3）将蜡块置入冰水中，使其变硬。
（4）迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。
（5）将载玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。
（6）迅速进行HE染色。
5．注意事项（1）为了尽量缩短制片时间，必须预先作好有关准备工作，备齐取材用具、试管、固定液、丙酮、酒精灯、火柴（或其他引火器）、包埋用蜡块、载玻片和染色试剂等，放在固定部位待用。
（2）全部制片过程一般在20~25min内完成。
（3）制片后剩余组织块应作常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。
（4）含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。
（5）用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。
（6）丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m距离内不得存在明火。
加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。
㈡超声波快速处理仪石蜡切片法（参照有关厂商的说明书操作）。
四、冷冻组织切片的制备㈠应用恒冷箱切片机制备切片：是目前最适用方法。
恒冷箱切片机种类较多，应严格按有关厂商的说明书操作。
用于切片的标本必须未曾固定。
㈡应用开放式冷冻切片机制备切片1．二氧化碳制冷切片（1）将组织块放在冷冻台上，滴加OCT或羟甲基纤维素液于组织块周围（将组织块包埋），使固定在切片机上的切片刀接近组织块表面。
石蜡包埋步骤
石蜡包埋步骤
石蜡包埋步骤
一、组织固定
按1：20将组织放入固定液【小块组织如卵巢可放入2ml EP管中加入2ml的bouins 固定液（4℃冰箱摇床中2~3h）或PFA固定液】；如果不进行下一步，可放于70%酒精中4℃冰箱中长期保存。
1组织脱水、渗透与包埋
○1脱水：
70% 乙醇（30min）→85%乙醇(30min) →95%乙醇(30min)→100%乙醇(30min)→100%乙醇(30min)。
注：○1若组织数量过多时，应分开脱水（20个组织左右）
○2脱水的体积至少为组织体积的4倍
○3乙醇纯度越高时，脱水的时间减少，否则引起组织过硬
○4最好能搅拌，使脱水充分
○2透明：
二甲苯I (30min)→二甲苯II(30min)。
注：在二甲苯的时间不宜过短或过长。
时间过短引起透明不充分，影响后面渗透包埋；时间过长则引起组织变脆。
○3渗透：
石蜡I (60min)→石蜡II(60min),62℃烘箱中。
○4包埋：
将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。
注：包埋时，切忌用手按石蜡盒中间，因为冷凝后，中间仍较软。
2 切片和贴片
将包埋好的组织块于切片机中约5μm，放于漂片机中展开，再将切片捞于多聚赖氨酸附膜载玻片上，编号，70℃干烤1h，贴片后60℃烤5h。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
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一、制备显微标本的切片法一石蜡包埋切片制作法这是最常用的切片法。
以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。
用切片机制取极薄的切片。
为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。
过程大致如下：⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。
因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。
凡供永久保存的标本都需经固定处理。
常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。
还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。
⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。
通常用乙醇（AlcohoI ,酒精），浓度递升到100%。
此过程还使组织块进一步硬化。
⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。
通常用二甲苯（xylene ）为透明剂。
⑷浸蜡：在温箱内进行。
已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。
⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。
⑹切片：用切片机。
常用的切片机有轮转式、平推式的。
用轮转式的易于切出连续切片。
切片厚度随制片目的而调整。
教学标本厚度多是5~6卩m。
⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。
染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。
二冷冻切片法冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。
冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。
恒冷切片机是高级冷冻切片设备。
它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。
恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。
切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。
冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。
并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。
所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。
二、显示标本结构成分的染色法一苏木素伊红染色法（HE染色法）为最常用的染色法。
该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。
下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。
1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。
2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。
3、蒸馏水略洗。
4、苏木素溶液染色约5 —15分钟5、自来水洗去多余染料。
6、入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无色为合适。
7、分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色。
这一步骤也可称为“蓝化”。
8、入蒸馏水洗去碱性水分。
9、入70%酒精一8%酒精各5分钟。
10、入伊红染液染色30秒至数分钟。
11、以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。
12、上行脱水：染色后的切片，因组织内含水而不透明，不能清晰地观察其微细结构。
因此，须将组织内的水分经各级酒精一无水酒精逐步置换，最后进入不含水份的透明剂内。
13、透明：入二甲苯透明剂，二次（各数分钟）。
14、取出切片：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。
结果：细胞核蓝紫色，胞浆、胶原纤维、肌纤维为桃红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，弹性纤维呈明亮桃红色。
二组织化学和细胞化学染色法组织化学和细胞化学，是将物理和化学的技术运用到组织标本，用显微镜和化学分析方法来研究组织和细胞内的化学成分，并观察该化学成分在组织、细胞内的定位、含量及其变化规律。
这些化学成分借着化学反应所产生的不溶性着色物质来显示。
对于某些化学成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或间接的化学反应产生着色沉淀而显示其部位和相对含量。
对于酶类，显示它的活性，须有该种酶的底物（被该种酶作用的物质），由酶对底物的分解，直接或间接地生成着色物质而被显示。
凡是在光学显微镜下观察细胞原位显示的化学物质，称组织化学，若用电镜观察细胞原位化学成分的着色部位，则称电镜细胞化学，下面从原理方面简要介绍几种常用的组织化学染色技术：1、显示琥珀酸脱氢酶（SDH ）活性的硝基-BT法：（Succi nate dehydroge nase ）⑴酶的定位及生物学意义：琥珀酸脱氢酶是线粒体标志酶，其存在于所有有氧呼吸的细胞，和线粒体内膜紧密结合。
该酶不需辅酶而自身有黄素蛋白（FP,Flavoprotein ）为辅基。
在组化反应中常用来反映三羧酸循环的情况。
其催化过程如下：弱-单甲（紫红色）HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2 四唑（甲）J（有色）强-双甲（深紫蓝色）（琥珀酸）（黄素蛋白）HOOC-CH=CH=COOHFPH2 四唑（无色）（延胡索酸）⑵原理：上述的反应最后一步的原理是，硝基-BT （Nitro-blue tetrozolyum ，四唑氮蓝）系异环族化合物四唑盐，当它接受氢时，本身被还原为有色沉淀产物（甲）（Formazan ）。
⑶孵育液配制：A液（贮备液）0.2M磷酸缓冲液（PH7.6）10ml等量混合0.2M 琥珀酸钠（SOl.succinate ）10ml 备用B液：硝基四唑（Nitro-Br ）2mg2ml0.2M 磷酸缓冲液（PH7.6）2ml取：A液2mlB液2ml孵育液聚乙烯吡烷酮（PVP）300mg⑷方法：①新鲜恒冷箱冷冻切片，厚6~8卩m,平贴在盖玻片上。
②滴染法：将有冷冻切片的盖玻片（标本面朝上）平放于预热好的培养皿中（底部垫一湿滤纸），滴加孵育液至全部覆盖组织，于37 T温箱中孵育45~60分钟（肝，心肌组织15分钟即可）。
③于生理盐水中冲洗二次（轻晃，以防脱片）。
④10%福尔马林生理盐水固定10分钟。
⑤15%酒精浸洗5分钟（换二次）。
⑥甘油明胶封片。
⑸结果：酶活性强处呈蓝色颗粒（双甲沉淀），酶活性较低时形成紫红色单甲。
在光镜下，该酶活性于肝小叶内分布呈明显分带现象，周边带强于中央带。
在心肌细胞纵切面，酶活性颗粒沿心肌细胞长轴整齐排列，相邻心肌细胞的空白处为闰盘。
2、显示葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase )活性的铅法：(Glucosel-phosphate phosphohydrolase )①酶的定位及其生物学意义：该酶主要位于内质网，是内质网的标志酶。
G-6-Pase参与糖代谢，能水解葡萄糖-6-磷酸而释放出葡萄糖和磷酸。
⑵原理：G-6-Pase将底物(葡萄糖-6-磷酸钾盐)水解产生磷酸离子，后者被孵育液中的硝酸铅所捕获，最终反应物为颗粒状的硫化铅沉淀，其反应式如下：酶Pb(NO3)2葡萄糖-6-磷酸钾+H2O葡萄糖+磷酸(NH4)2SPb2(PO4)2PbS J(无色)(棕色)(试剂配制及方法详见组织学技术专著)⑶结果：酶活性部位呈棕色硫化铅颗粒沉淀。
在光镜下G-6-Pase活性颗粒较均匀地分布于胞质中3、显示碱性磷酸酶(APL)的钙钻法(Alkaline phosphohydrolase )⑴酶的定位及其生物学意义：ALP在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，参与磷酸根的跨膜转运过程，并有磷酸转移的作用，故在细胞膜上运输较活跃，如毛细血管内皮细胞，肾近曲小管刷状缘，肠上皮纹状缘等处，该酶的活性较高。
⑵原理：ALP将磷酸盐底物(如伕甘油磷酸钠等)分解产生磷酸根离子，后者为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，但该沉淀为非金属盐，需加入硝酸钻, 使其生成磷酸钻沉淀，因无色，再需通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钻沉淀而被显示。
在PH9.2 —9.4环境中表现最大活性。
反应式如下：ALPCa++禺甘油磷酸钠磷酸离子Ca2(PO4)2Co(NO3)2(NH4)2SCO2 (PO4) 2CoS J(无色)(棕黑色)⑶结果：酶活性部位为棕黑色CoS沉淀。
4、显示核酸的甲绿一派喏宁(Methyl gree n-pyro nln )染色：⑴原理：甲绿和派喏宁都是碱性染料，对两种核酸(DNA和RNA)能分别染色, 其机制可能在于两种核酸分子都是多聚体，但聚合程度有所不同。
甲绿具有两个带电荷的氨基，而派喏宁只有一个。
因此在混合的染液中，二者竞争的结果是甲绿易与聚合程度较高的DNA结合呈现蓝绿色，而派喏宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色。
(试剂制备及方法详见组织学技术专著)⑶结果：核内DNA呈蓝绿色，核仁及胞质内RNA呈桃红色。
5、显示糖原的过碘酸雪夫氏（PAS）反应：⑴原理：糖原是一种动物多糖，无色，富含于肝细胞和肌细胞胞质中。
PAS反应（Periodic acid schiff Reaction ）能在糖原所在部位生成紫红色物质，从而将之显示。
RAS反应分为两步：首先是强氧化剂过碘酸（Periodic acid,分子式为HI04 ），将糖原中的葡萄糖分子的C-C键打开，将CHOH-CHOH氧化，生成二醛基，然后Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与糖的醛基结合，生成新的紫红色复合物。
HIO4schiff 试剂多糖醛基紫红色反应产物（氧化）（试剂配制及方法详见组织学技术专著）⑵结果：糖原呈紫红色颗粒状。