9酶标记免疫技术
酶免疫技术的实验报告
酶免疫技术的实验报告实验目的：本实验旨在通过酶免疫技术（Enzyme Immunoassay, EIA）来检测特定抗原或抗体的存在，了解其原理和应用，提高实验操作技能。
实验原理：酶免疫技术是一种利用酶标记的抗体或抗原进行检测的方法。
它结合了酶的催化活性和免疫反应的特异性，通过酶的催化作用放大信号，提高检测的灵敏度。
常用的酶免疫技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等。
实验材料：1. 待测样本：含有目标抗原或抗体的生物样本。
2. 酶标记的抗体或抗原：用于与待测样本特异性结合。
3. 酶底物：与酶反应产生可检测的信号。
4. 标准品：用于建立标准曲线，定量分析。
5. 洗涤液：用于去除未结合的酶标记物。
6. 酶标仪：用于测定吸光度或荧光强度。
实验步骤：1. 准备实验所需的试剂和材料，包括待测样本、酶标记物、酶底物、标准品等。
2. 根据实验设计，选择合适的ELISA方法（直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等）。
3. 将待测样本和标准品按照一定比例稀释，并加入到预先包被的酶标板中。
4. 孵育一定时间后，用洗涤液清洗酶标板，去除未结合的样本和酶标记物。
5. 加入酶底物，使酶催化底物产生可检测的信号。
6. 在酶标仪上测定吸光度或荧光强度，记录数据。
7. 根据标准品的吸光度或荧光强度，建立标准曲线，计算待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验结果：通过实验操作，我们得到了以下结果：- 标准曲线的建立：根据标准品的吸光度或荧光强度，绘制出标准曲线，其线性关系良好。
- 待测样本的定量分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验讨论：在本实验中，我们成功地应用了酶免疫技术来检测特定抗原或抗体的存在。
实验结果表明，酶免疫技术具有较高的灵敏度和特异性，适用于生物医学研究和临床诊断。
然而，实验过程中也存在一些局限性，如酶标记物的稳定性、非特异性结合等问题，需要进一步优化实验条件。
实验结论：通过本次实验，我们掌握了酶免疫技术的原理和操作流程，能够利用该技术进行生物样本中特定抗原或抗体的检测。
酶标抗体技术原理
酶标抗体技术原理酶标抗体技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的免疫分析技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的存在。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA 等几种不同的变体，但它们都遵循相似的基本步骤和原理：1.固定抗原：首先，在实验容器（如酶标板）的表面上固定特定抗原。
这可以通过将抗原直接吸附在容器表面上或使用化学交联剂来完成。
2.样品处理：样品（可能含有待检测抗原或抗体）与固定抗原接触，使待检测物质与抗原结合。
这样，如果待检测的是抗原，那么抗原将与固定的抗体结合；如果待检测的是抗体，那么抗体将与固定的抗原结合。
3.第一次抗体结合：添加与待检测物质特异性结合的第一次抗体。
这个抗体会与样品中的待检测物质结合，形成抗原-抗体复合物。
4.第二次抗体结合：添加与第一次抗体特异性结合的酶标记的第二次抗体。
这个酶标记的抗体将与第一次抗体结合，形成一个二抗-一抗-抗原复合物。
5.酶标记物检测：加入适当的底物，使酶标记的第二次抗体产生染色反应。
底物的选择取决于所使用的酶标记，常见的酶标记有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
产生的染色反应可以通过光密度测量仪（spectrophotometer）进行定量测量。
6.结果分析：根据染色反应的强度，可以确定待检测物质的存在和浓度。
一般来说，反应的光密度与待检测物质的浓度成正比。
通过酶标抗体技术，可以检测和定量多种抗原或抗体，广泛应用于医学诊断、药物研发、免疫学研究等领域。
9酶免疫技术
酶免疫技术（一）单项选择题（A型题）1、HRP的活性基团是A．糖蛋白B．亚铁血红素C．白蛋白D．球蛋白E．色氨酸2、表示HRP纯度（RZ）的是A．入403nm/入275nm B．入420nm/入275nm C．入403nm/入290nmD．入275nm/入403nm E．入290nm/入275nm3、HRP（用于标记）的RZ值应大于A．3.0 B．3.1 C．3.2D．3.3 E．3.44、β-Gal的常用底物是A．OPD B．TMB C．5-ASAD．ABTS E．4MUG5、下列酶-底物-颜色反应组合中，正确的是A．HRP—OPD—蓝色B．HRP—TMB—红色C．AP—P—NPP—黄色D．HRP—P—NPP—蓝色E．AP—TMB—蓝色6、AMIT测定可以测定A．大分子抗原B．小分子抗原或半抗原C．补体D．PcAb E．McAb7、应用最广泛的均相EIA是A．CEDIA B．SPEIA C．AMITD．ELISA E．IFA8、关于酶免疫技术的特噗，正确的是A．酶标记物催化抗原反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度B．酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差C．底物以酶催化后的成色，使酶标主免疫反应结果得以放大D．选择高度质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提E．酶免疫技术检测方法较为繁琐9、关于固相化抗体的制备，正确是的A．抗体包被固相载体后，再用小牛血清蛋白包被一次为了稳寄存载体对抗体的吸附B．化学偶联包被抗体，可有效提高包被抗体的结合量．均一性和牢固程度C．为提高抗体的包被量，包被液的浓度应较高D．吸附法包被抗体时，选用偏酸性的缓冲液，可提高包被抗体的稳定性E．包被抗体时，温度越高越有利于提高包被抗体的稳定性10、关于载体的选择，正确的是A．醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全B．高分子微颗粒载体含有的基团易与抗体蛋白形成化学偶联，且结合容量大C．塑料制品吸附蛋白分子的稳定性和均一性好D．固相微颗粒因体积小，不易与磁性材料组合使用E．膜载体吸附抗体蛋白一般是采用化学偶联法11、酶免疫技术和于样品中抗原或抗体的定量测定是基于A．酶标记物参与免疫反应B．固相化技术的应用，使结合和游离的酶标记物能有效地分离C．含酶标记的的免疫复合物中酶可催化底物成色，其颜色的深玫与待测物含量相关D．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈正比E．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈反比12、关于HRP，描述正确的是A．HRP由具酶活性的蛋白主酶和亚铁血经素辅基构成B．测定HRP的RZ值，可判断酶活性的高低C．HRP对酶催化反尖中的受氢体专一性要求不高D．酶变性后，其RZ值不变E．邻苯二氨底物液被HRP催化显蓝色，其最大吸收波长为492nm13、均相酶免疫测定的基本特征是A．以应平衡后，抗原抗体复合物中酶活性人发生变化B．酶标抗原与抗体在固相介质表面形成复合物后，作用于底物成分C．不用分离B．F即可确定待测物质的含量，表明其反应不易受内源性酶的干扰D．反应属于非竞争结合，测定的灵敏度较高E．测定方法较为复杂，且不易用于自动化检测14、司于均相酶免疫测定的方法是A．酶联免疫化学光测定B．dot-ELISA C．双抗体夹心法ELISAD．酶增强免疫测定技术E．竞争法ELISA15、反应结束时，阴性以照管的呈色最强，此情况常见于A．双抗体夹心法ELISAB．竞争法ELISA C．间接法ELISA D．捕获法ELISA E．双抗原夹心法ELISA16、免疫渗滤试验衍生于A．RIA B．dot-ELISA C．免疫层析试验D．免疫印迹试验E．免疫扩散试验17、双位点DLISA中，造成抗原测定值低于实际含量的常见原因是A．固相抗过多B．反应时间不够C．标记抗体过多D．待测物过浓E．洗涤不彻底18、间接法ELISA中，形成的免疫复合物是A．固相抗原-抗体-酶标二抗B．固相抗体-抗原-酶标抗体C．固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体D．固相抗体-酶标抗原固相二抗-抗体-酶标抗原19、下述酶免疫组织化学技术中，敏感性最高的方法是A．直接染色法B．间接染色法C．酶桥法D．过氧化物酶-抗过氧化物酶法E．亲和素-生物素-过氧化物酶技术20、酶桥染色法中的桥抗体是指A．免疫反应系统中的特异性抗体B．显色系统中的抗酶抗体C．第二抗体（抗抗体）D．第一抗体E．第三抗体（抗酶抗体）21、酶免疫组织化学技术中，常作的酶是A．胰蛋白酶，葡萄糖氧化酶B．辣根过氧化物酶，碱性磷酸C．胃蛋白酶，蛋白酶K D．碱性磷酸酶，胃蛋白酶E．葡萄糖氧化酶，蛋白酶K22、下列属于非标记免疫技术的是A．荧光标记免疫技术B．酶标免疫技术C．放射性核素标记免疫技术D．发光免疫技术E．免疫电泳技术23、制备ABC复合物时，亲和素的浓度不能高于A．10μg/mlB．20μg/mlC．30μg/mlD．35μg/mlE．40μg/ml 24、制备ABC复合物时，HRP-B的浓度不能高于A．2μg/mlB．4μg/mlC．6μg/mlD．8μg/mlE．12μg/ml25、PAP复合物中的酶是A．胶原酶B．胃蛋白酶C．葡萄糖氧化酶D．碱性磷酸酶E．辣根过氧化物酶26、免疫组化技术的优点不包括A．高特异性B．高敏感性C．形态学的直观性D．精确定量分析E．能对抗原表达情况进行分析27、与其他标记技术相比，免疫组化技术最大的优点是A．高特异性B．高敏感性C．形态学的直观性D．重复性好E．精确度高28、ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术A．1961年B．1975年C．1981年D．1985年E．1990年29、PAP技术中酶的底物为A．TMBB．DABC．PNPD．TMBSE．OPD30、免疫组化技术不包括A．酶免疫组化B．酶免疫印迹C．荧光抗体染色D．免疫金细胞染色E．免疫电镜技术31、用于标记的HRP的RZ值应大于A．2.4B．3.0C．1.5D．3.5E．5.032、RZ表示A．酶活性B．催化效率C．标记率D．酶纯度E．效价33、HRP与底物TMB反应后的测定波长为A．278nmB．450nmC．403nmD．495nmE．492nm34、HRP与底物OPD反应后的测定波长为A．278nmB．450nmC．403nmD．495nmE．492nm35、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈A．蓝色B．橙黄色C．棕黄色D．黄色E．紫色36、每个亲和素能结合生物素分子的数目是A．4B．2C．1D．3E．837、生物素分子中与亲和素结合的部位是A．噻吩环B．咪唑酮环C．苯环D．羧基E．—NH—38、ELISA双抗体夹心法( )A．将酶标记特异抗体用于检测抗原B．先将待测抗原包被于固相载体C．标记一种抗体可检测多种抗原D．能用于半抗原的测定E．将酶标记抗抗体用于抗原检测39、HRP(用于标记)的RZ值应大于( )A．3.0B．3.1C．3.2D．3.3E．3.440、HRP的供氢体是( )A．TMBB．H OC．小分子醇过氧化物D．尿素过氧化物E．以上都不是41、关于ELISA的底物OPD的特点哪一条不正确( )A．具有致癌性B．灵敏度高C．比色方便D．配成应用液后稳定性好E．与酶反应后显橙黄色42、关于HRP，描述正确的是( )A．HRP由具酶活性的蛋白主酶和亚铁血红素辅基构成B．测定HRP的RZ值，可判断酶活性的高低C．HRP对酶催化反应中的受氢体专一性要求不高D．酶变性后，其RZ值不变E．邻苯二氨底物液被HRP催化显蓝色，其最大吸收波长为492nm44、HRP的活性基团是( )A．糖蛋白B．白蛋白C．球蛋白D．亚铁血红素E．色氨酸45、间接法ELISA中，形成的免疫复合物是( )A．固相抗体-抗原-酶标抗体B．固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体C．固相抗体-酶标抗原D．固相二抗-抗体-酶标抗原E．固相抗原-抗体-酶标二抗46、制作ELISA载体材料最常用的的物质是( )A．聚氯乙烯B．聚苯乙烯C．硝酸纤维素膜D．尼龙膜E．磁性微粒47、用ELISA双抗体夹心法检测血清中甲胎蛋白(AFP)，应选择的固相包被物是( )A．已知AFPB．酶标记AFPC．抗AFP抗体D．酶标记抗AFP抗体E．待检血清48、ELISA中最常用的酶是( )A．葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶B．β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶C．葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶D．脲酶和碱性磷酸酶E．辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶49、关于ELISA的固相载体论述有误的是( )A．最常用的是聚苯乙烯微量反应板B．每一批号的聚苯乙烯在使用前需检查其性能C．聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯低D．阳性和阴性标本测定结果差别最大者是最适用载体E．微孔滤膜也可作固相载体50、最常用于IgM测定的ELISA方法是( )A．双抗体夹心法B．间接法C．竞争法D．捕获法E．dot-ELISA法51、表示HRP纯度(RZ)的是( )A．λ275nm/λ403nmB．λ403nm/λ275nmC．λ290nm/λ275nmD．λ420nm/λ275nmE．λ403nm/λ290nm52、关于载体的选择，正确的是( )A．醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全B．高分子微颗粒载体含有的基团易与抗体蛋白形成化学偶联，且结合容量大C．塑料制品吸附蛋白分子的稳定性和均一性好D．固相微颗粒因体积小，不易与磁性材料组合使用E．膜载体吸附抗体蛋白一般是采用化学偶联法53、ELISA间接法通常用来检测( )A．抗体B．抗原C．免疫复合物D．抗抗体E．半抗原54、均相酶免疫测定的优点不包括( )A．多用于小分子激素和半抗原的测定B．勿需分离游离的酶标抗原C．易于自动化分析D．不易受样品中非特异的内源酶的干扰E．灵敏度可达10～9mol/L55、酶增强免疫测定技术(EMIT)是一种( )A．固相酶免疫测定技术B．液相酶免疫测定技术C．均相酶免疫技术D．酶免疫组织化学技术E．酶免疫测定与电泳相结合的技术56、酶桥染色法中的桥抗体是指( )A．免疫反应系统中的特异性抗体B．显色系统中的抗酶抗体C．第一抗体D．第二抗体(抗抗体E．第三抗体(抗酶抗体)57、ELISA中用于某种特异抗体的亚型测定常采用的方法是( )A．双抗体夹心法B．捕获法C．竞争法D．间接法E．双抗原夹心法58、与双抗体夹心法相比，ELISA间接法的主要优点是( )A．有较大的放大作用B．减少了操作步骤C．减少了冲洗次数D．可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体E．缩短反应时间59、关于ELISA竞争法正确的是( )A．用于检测抗原B．被检测物与酶标记物的免疫活性各不相同C．被测物多则标记物被结合的机会少D．待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少E．只用于检测抗体60、斑点ELISA与常规ELISA比较不同之处在于( )A．二者实验原理不同B．二者所用固相载体不同C．二者所用酶不同D．二者所用酶标抗体不同E．以上都不对61、ELASA板包被后，最常用的封闭物质是( )A．人白蛋白B．人球蛋白C．牛血清白蛋白D．牛血清球蛋白E．鼠白蛋白62、免疫渗滤试验衍生于( )A．免疫扩散试验B．免疫层析试验C．免疫印迹试验D．dot-ELISAE．RIA63、目前国内ELISA常用的酶是A.HRPB.APC.β-GalD.OPDE.TMB64、双抗体夹心ELISA可用于检测A.CEAB.胰岛素C.吗啡D.ANAE.RF65、何种ELISA方法其酶标二抗具有通用特性A.双抗体夹心B.一步法C.捕获法D.竞争法E.间接法66、间接ELISA可用于检测A.AFPB.胰岛素C.HIV抗体D.吗啡E.HBsAg67、酶免疫印迹所用的固相材料为A.NC膜B.聚苯乙烯C.磁性颗粒D.尼龙膜E.凝胶68、捕获法测定病原体抗体的类别是A.IgMB.IgGC.IgAD.IgDE.IgE69、以碳酸盐作为包被缓冲液，最佳pH为A.7.2B.7.4C.7.0D.8.6E.9.670、目前通用标记HRP的试验方法为A.戊二醛交联B.过碘酸钠氧化C.琥珀酸酐法D.混合酸酐法E.碳化二亚胺法71、生物素分子中可进行修饰，形成各种活化生物素的基因是A.Ⅰ环B.Ⅱ环C.羧基D.羟基E.酮基72、链霉亲和素的活性单位是以结合多少生物素所需的量来表示A.1μgB.2μgC.3μgD.4μgE.5μg73、免疫组化技术的关键步骤是A.标本处理B.抗体的处理与保存C.免疫染色D.设立对照试验E.结果判断74、PAP复合物中的酶是A.胶原酶B.胃蛋白酶C.葡萄糖氧化酶D.碱性磷酸酶E.辣根过氧化物酶75、组化染色前，应对标本进行固定，其最主要的目的是A.保存组织细胞的抗原性B.防止细胞脱落C.防止细胞自溶D.终止胞内酶的活性E.使细胞内蛋白质凝固76、免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体充分反应，理想的温度是A.4℃B.25℃C.56℃D.37℃E.50℃77、下列不是激光光源特征的是A.单色性强B.波长范围较宽C.亮度高D.相干性好E.方向性强78、免疫组化技术基质的来源，错误的是A.活体组织B.血清C.病毒D.培养细胞E.细菌79、微孔板包被后，加入高浓度蛋白封闭空白位点，这一过程称为A．包被B．封闭C．本底D．钩状效应E．基质效应80、与假阴性测定结果密切相关的是A．包被B．封闭C．本底D．钩状效应E．基质效应81、未加入待测物质，试验结束后测定的OD值称为A．包被B．封闭C．本底D．钩状效应E．基质效应82、标记蛋白质氨基的活化生物素为A．N-羧基丁二酰亚胺酯（BNHS）B．生物素酰肼（BHZ）C．肼化生物素（BCHZ）D．光敏生物素E．生物胞素（MPB）83、标记核酸的活化生物素为A．N-羧基丁二酰亚胺酯（BNHS）B．生物素酰肼（BHZ）C．肼化生物素（BCHZ）D．光敏生物素E．生物胞素（MPB）84、标记蛋白质醛基的活化生物素为A．N-羧基丁二酰亚胺酯（BNHS）B．生物素酰肼（BHZ）C．肼化生物素（BCHZ）D．光敏生物素E．生物胞素（MPB）85、在PAP技术中，起“桥联”作用的成分是A．Ab1B．Ab2C．anti-HRPD．HRPE．anti-AP86、在PAP技术中，与特异性抗体（Ab1）具有同种型抗原表位的成分是A．Ab1B．Ab2C．anti-HRPD．HRPE．anti-AP87、在PAP技术中，能特异性识别待检抗原的成分是A．Ab1B．Ab2C．anti-HRPD．HRPE．anti-AP88、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是A．BABB．ABCC．BRABD．BAE．LAB89、在ABC- ELISA技术中，亲和素与生物素化酶的比例关系是A．1︰4B．1︰2C．2︰1D．4︰1E．1︰1三、名词解释1．酶免疫技术：是指利用酶的高效催化和放大作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标记免疫技术。
第三版免疫学检验技术第9-13章中级试题及答案
第九章酶免疫技术一、A11、下图所示的为哪一种ELISA技术的反应原理示意图（）。
A、双抗原夹心法B、双位点一步法C、间接法测抗体D、竞争法E、捕获法2、钩状效应是指用ELISA一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A、低，高B、高，高C、高，低D、低，低E、高，不变3、ELISA试验中最常用的标记酶是（）。
A、ASTB、HRPC、ACPD、LDHE、ALT4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A、均相酶免疫测定B、异相酶免疫测定C、固相酶免疫测定D、液相酶免疫测定E、固相-液相酶免疫测定5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A、双抗体夹心法B、双位点一步法C、间接法D、竞争法E、捕获法6、ELISA中最常用的固相载体是（）。
A、聚氯乙烯B、聚苯乙烯C、三聚氧胺D、琼脂糖E、尼龙膜7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A、常用于半抗原和小分子的检测B、操作简便，易于自动化C、不易受样品中的内源性酶的干扰D、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E、灵敏度不及异相酶免测定8、酶增强免疫测定技术（EMIT）是一种（）。
A、非均相酶免疫测定技术B、均相酶免疫测定技术C、酶免疫组织化学技术D、酶免疫测定与电泳相结合的技术E、电泳技术9、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A、人白蛋白B、人球蛋白C、牛血清白蛋白D、牛血清球蛋白E、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A、抗HCV B、HIV C、HCG D、HBsAg E、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A、戊二醛交联法B、糖原染色法C、免疫印迹法D、酶耦联测定法E、捕获竞争法12、下列不属于ELISA测定方法中所必需的试剂（）。
A、固相的抗原或抗体B、酶标记的抗原或抗体C、酶作用的底物D、戊二醛交联剂E、稀释的血清13、斑点免疫层析试验最常用的载体材料是（）。
酶联免疫标记技术
酶联免疫标记技术酶联免疫标记技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于检测生物样本中特定蛋白质、抗体、荷尔蒙、抗原等的定量和定性方法。
该技术利用酶与抗原-抗体复合物相互作用的原理，通过酶的催化作用将底物转化为可检测的产物，从而实现对目标分子的检测和测量。
ELISA技术通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等不同类型，但它们的基本原理相似。
以下是酶联免疫标记技术的基本步骤：1．包被阶段（Coating）：将要检测的抗原或抗体吸附在固体表面上，如微孔板的底部或壁上。
2．阻断阶段（Blocking）：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶等）阻断未被包被的表面，以减少非特异性结合。
3．结合阶段（Binding）：将待测样本加入到包被的微孔板中，目标分子与包被的抗体或抗原发生特异性结合。
4．洗涤阶段（Washing）：使用缓冲液洗去未结合的样本成分，以减少背景干扰。
5．检测阶段（Detection）：加入与目标分子特异性结合的检测抗体，形成抗原-抗体复合物。
6．洗涤阶段（Washing）：再次使用缓冲液洗去未结合的检测抗体。
7．酶标记阶段（Enzyme Labeling）：加入与检测抗体特异性结合的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
8．底物加入阶段（Substrate Addition）：加入底物，酶催化底物产生可检测的产物。
9．测量阶段（Measurement）：使用光度计或荧光测量仪器测量产物的光学密度或荧光强度，从而定量目标分子的浓度。
ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本较低等优点，因此在医学诊断、生物医学研究、药物开发等领域被广泛应用。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶免检测技术原理及影响
2、反应环境条件： 电解质 酸8·碱5度g/LNaCl溶液
酸碱度 pH6--9为宜
温 度 温最适度温度为37℃
.
11
二、酶免疫技术的分类、特点及原理
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12
1、酶免技术的分类
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酶 免 疫 技 术
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
均相 1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA 小分子激素、半抗原测定
2加样量不一致3孵育时间不一致4洗涤条件不同5操作人员不同阳性对照不显1把终止液误当作酶结合物或底物使用严格按试剂说明书操作加液时看准标签正确稀释洗涤液不要漏加试剂2漏加试剂如酶结合物底物a3蒸馏水被污染或盛洗涤液桶被污染留有使酶失活的物质换用合格水盛蒸馏水的瓶子要洁净现象可能原因解决方法1底物失效或被污染更换底物2加好底物后在保温时受强光或紫外线照射显色时避光保温3反应时间过长准确定时4水浴箱温度过高调准水浴箱温度5加酶量过多50ul误当100ul
.灰区是客观存在的，没 有不存在灰区 的试剂， 我们只是尽量减少灰区的 出现比例。 .减少灰区最有效的方法 就是尽量将板洗涤干净。
.
33
五、ELISA法检测常见问题及解决方法
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34
ELISA实验常见问题及解决方法
内源性标本因素 ：
p 类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包
.
35
现象
可能原因
解决方法
1、试剂盒未平衡至室温 2、水浴箱温度不到37℃
实验前试剂盒置于室温平衡30分钟 以上
调整水浴箱温度至37℃ 孵育期间不宜多开门
3、孵育时间不够
显 色 4、样品加样量偏少
淡 5、酶结合物加样量偏少
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
免疫标记技术的应用原理
免疫标记技术的应用原理什么是免疫标记技术免疫标记技术是一种利用免疫反应特异性和可检测的性质将抗原或抗体标记并追踪的方法，广泛应用于生物医学领域。
该技术基于免疫学的原理，通过选择性地结合特定抗体和其对应的抗原，在细胞、组织或生物样品中检测、定位和分析特定分子的表达和功能。
免疫标记技术的应用领域免疫标记技术被广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。
以下是免疫标记技术的主要应用领域：1.免疫组织化学：用于检测、定位和分析特定蛋白质在组织和细胞中的表达和分布，从而了解其功能和相互作用关系。
2.免疫细胞学：用于分析和鉴定细胞表面标志物、细胞分型和免疫细胞亚群等方面的研究。
3.流式细胞术：用于检测和定量特定细胞表面标志物的表达水平和细胞数量，广泛应用于免疫学、肿瘤学等领域。
4.免疫组学：用于分析和鉴定蛋白质组学中的特定蛋白质和蛋白质修饰，从而研究蛋白质与疾病、代谢和信号转导等之间的关系。
5.免疫流电法：用于检测和定量细胞表面标志物或药物靶点的表达和结合情况，广泛用于生物药物研究和开发。
免疫标记技术原理免疫标记技术基于免疫学的原理，利用抗体与其对应的抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现目标分子的检测和定位。
以下是常用的免疫标记技术原理：1.免疫荧光染色：该技术利用荧光标记的二抗与目标抗体结合，通过检测荧光染色来观察目标蛋白在组织或细胞中的表达和分布。
2.酶标记技术：该技术利用酶标记的抗体或抗原，在加入底物后通过酶的催化作用产生染色反应，从而可定量分析目标蛋白的含量和活性。
3.放射性标记技术：该技术利用放射性同位素标记的抗体或抗原，通过检测放射性同位素的辐射来实现对目标分子的定量检测。
4.磁性标记技术：该技术利用磁性颗粒标记的抗体或抗原，通过磁场的作用将目标分子分离或聚集，从而实现对目标分子的检测和分析。
免疫标记技术的优势和局限性免疫标记技术具有以下优势：•高度特异性：免疫标记技术基于抗体和抗原之间的特异性结合，具有较高的检测灵敏度和特异性。
酶免疫技术名词解释
酶免疫技术名词解释酶免疫技术是一种广泛应用于生命科学、生物技术和医学领域的技术。
它是利用酶作为探针，实现分子分析和检测的一种方法。
酶免疫技术拥有许多独特的优点，如高度灵敏、特异性强、操作简便等，因此被广泛应用于临床诊断、生物医学研究、环境监测和食品安全等领域。
下面是一些关于酶免疫技术相关的名词解释。
1. 酶标记：酶标记是指在酶免疫技术实验中，通过对探针分子进行修饰，使其与酶结合并形成稳定的复合物。
这种复合物可以作为信号源，在检测过程中被检测出来。
2. 性能参数：在酶免疫技术实验中，用来评估探针的性能的参数。
包括特异性，敏感性，可重复性等。
这些参数决定了实验的可靠性和准确性。
3. 单抗：单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是一种特殊的抗体，可与目标分子的特定区域（表位）结合。
在酶免疫技术实验中，单抗被广泛应用于酶标记和检测分析。
4. 酶免疫法（ELISA）：酶免疫法是一种利用酶做为标记物，通过对抗体与抗原之间的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
这种方法广泛应用于多种疾病的诊断和治疗。
5. 酶反应体积：在酶免疫技术实验中，所需的反应体积越小，检测灵敏度越高。
然而，不同反应最优的体积需要通过实验来确定。
6. 活化酶底物：活化酶底物是一种反应物，被酶催化后可以产生可检测的信号，如荧光、发光、吸收光谱等。
在酶免疫技术实验中，活化酶底物被广泛应用于酶标记和检测分析。
7. 酶聚合素链反应（EPCR）：酶聚合素链反应是一种利用DNA聚合酶复制DNA分子的技术。
在酶免疫技术中，EPCR被广泛应用于检测遗传学分析。
8. 分子探针：分子探针是一种有机分子，在酶免疫技术中用于特定分子的检测。
它们可以与互补的DNA或RNA 配对，并用作免疫试剂或标记物。
分子探针在分子诊断学中起着至关重要的作用。
9. 酶抑制剂：酶抑制剂是一种分子化合物，可以抑制酶的活性。
在酶免疫技术中，酶抑制剂被广泛应用于检测分析中，以增加检测灵敏度和准确性。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
酶标抗体技术的原理及应用
酶标抗体技术的原理及应用引言酶标抗体技术是一种常用的生物化学分析方法，基于抗原与抗体的特异性识别和结合原理，通过特定的酶标记和相应基质的反应，实现对生物分子的定量或定性分析。
本文将介绍酶标抗体技术的原理及其在生物科学研究和临床诊断中的应用。
酶标抗体技术的原理酶标抗体技术的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原结合层：首先，需要制备含有抗原的固相材料，例如酶标板。
将待测样品或纯化的抗原加入酶标板孔中，在一定条件下使抗原与酶标板表面结合。
2.非特异性结合层的阻断：添加酶标抗体试剂，用以阻断非特异性结合。
这可以通过加入一些非特异性的蛋白质（如牛血清蛋白）来实现。
3.特异性结合层：添加与抗原特异性识别的抗体试剂，使其与抗原结合。
这些抗体一般被称为第一抗体。
4.酶标记抗体结合层：添加与第一抗体特异性识别的酶标记抗体试剂，使其与第一抗体结合。
这些酶标记抗体往往是用特定方法将酶固定在各种类型的抗体上。
5.酶标记抗体的检测：通过加入相应的基质，使酶标记抗体产生可测量的信号。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），其主要通过与底物反应产生颜色或荧光等信号。
酶标抗体技术的应用酶标抗体技术在生物科学研究和临床诊断中有广泛的应用，具体包括以下几个方面：1.生物学研究：酶标抗体技术可以用于检测和定量目标蛋白质、细胞因子、受体等的表达水平。
借助酶标抗体技术，研究人员可以对生物样品中的特定分子进行定量分析和功能研究。
2.免疫学研究：酶标抗体技术是免疫学研究中最常用的方法之一。
它可以用于检测和鉴定抗原、抗体、免疫球蛋白等，以及研究免疫应答的机制和变化。
3.临床诊断：酶标抗体技术在临床诊断中起着重要的角色。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种基于酶标抗体技术的常用诊断方法，可以检测流行病学调查、疫情监测、传染病诊断等。
4.药物研发：酶标抗体技术也广泛应用于药物的研发与评价。
通过酶标抗体技术，研究人员可以对药物与其作用靶点之间的相互作用进行定量分析，从而加快药物研发的过程。
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
简述酶免疫技术的分类
酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。
它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。
酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。
它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。
ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。
2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。
免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。
3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。
该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。
4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。
快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。
酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。
通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。
比较几种免疫检测的异同
免疫学课后作业比较几种免疫标记技术的异同。
答：根据标记物种类的不同，免疫标记技术可以分为放射免疫分析、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光标记免疫分析、胶体金标记免疫分析技术，它们之间具有相同点，也有不同之处，现将其归纳如下。
一、相同点主要包括以下几个方面：1、均具有高特异性。
五种免疫标记技术的免疫技术都是采用抗原抗体反应，而抗原与抗体的结合是一一对应、特异性结合的，故它们都具有非常高的特异性。
2、均具有高灵敏性。
由于五种免疫标记技术的标记技术均采用示踪物标记，例如酶、放色性核素、荧光素、胶体金以及致密物质等，当与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，只需测定复合物中的标记物，通过化学或物理的手段使不见的反应放大，转化为可见的、可测知的光、色、电、脉冲等信号，并可借助仪器精密测定，从而间接测出微量的抗原或抗体。
3、检测对象相同。
除了放射免疫技术只能检测抗原外，其他四种免疫标记技术均可检测抗原或者抗体，即通过已知抗原(或抗体)特异性结合待测抗体（或抗原），从而定性或定量地测出抗体或抗原。
4、免疫标记的程序基本相同。
其包括纯化抗原或抗体、确定标记物质（即决定了最终的检测方式）、进行标记、对标记产物分离纯化和分析鉴定等一系列程序。
二、不同点主要包括以下几个方面：1、检测原理不一样。
首先，酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原-抗体反应的特异性和酶催化底物反应高效性和专一性结合起来的一种免疫方法，其对作为标记用的酶具有特定的要求，如活性高、纯度高等；放射免疫标记技术是以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法；免疫荧光技术是以荧光素作为标记物与已知的抗体或抗原结合，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和坚定未知的抗原，其对用于标记的荧光素也有特定的要求，如荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等；发光免疫分析技术是将发光分析与免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，它是使用发光剂标记抗体（或抗原），通过发光检测抗原（或抗体）反应的免疫分析方法；免疫胶体金标记技术则是以胶体金作为示踪标记物，而胶体金在碱性环境中带负电荷，与抗体蛋白质分子的正电荷基团因静电而形成牢固结合应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测方法。
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一、原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
二、酶免疫技术类型
组织切片或细胞标本 中抗原或抗体的定位
酶免疫组织化学技术 酶放大免疫测定技术 酶免疫分析技术 酶免疫测定技术 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
酶及其作用底物
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
2.碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯水解
酶，因其敏感性高，空白值低，常用于EIA。
Ab-E AgAb-E+底物
显色
一、原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应
特点：
灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法。
对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
洗涤
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
其所生成的颜色深浅与欲测的抗 原（抗体）含量成一定比例。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原
二、方法类型及反应原理
ELISA测定的三个 必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA方法类型
（一）双抗体夹心法 （二）双位点一步法 （三）竞争法 （四）间接法 （五）捕获法测IgM抗体
酶标记抗体或抗原
技术方法简单、产率高，重复性好
制备方法要求
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性 酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
制备方法
戊二醛交联法
第三节
酶联免疫吸附试验
(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶及其作用底物
常用底物
HRP的底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
1.辣根过氧化物酶（HRP）：应用最广泛，从 辣根菜中提取， 由糖蛋白和辅基构成，辅 基主要成分是亚铁血红素，是酶活性的中 心。 HRP的优点：分子量小，标记物易透入 细胞；标记方法简单；溶解性好； 价格低 且有商品供应；底物种类多。
方法评价
ELISA操作简单、快速、敏感性高、
特异性强、实验设备要求简单、应用范 围广泛、无放射性污染、能定性及半微
量、微量、超微量定量分析。
是目前应用最广，发展最快的酶免
疫学技术方法。
ELISA的基本原理 ELISA的技术类型和原理 各种ELISA技术方法的特点
一、基本原理
原理
1
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
8
酶免疫测定技术 （1）均相测定技术： 不需将结合的与游离的酶标记物分离， 即可测定IC。 （2）非均相测定技术： 抗原抗体反应后需将结合的与游离的酶 标记物分离后才能测定。 包括：液相法： 固相法：（最常用）
第二节
酶标记物的制备
一、酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原、半抗原在 交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的 关键试剂。 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应， 还具有酶促反应，显示出生物放大作用， 但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同 的颜色反应.
碱性磷酸酯酶
黄色 红色
400 500 360,450 420
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 荧光 苷酶 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate） 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
酶
辣根过氧化物 酶
底 物
邻苯二胺 四甲基联苯胺 5-氨基水杨酸 2,2‘-氨基-2(3-乙基-苯 并噻唑啉磺酸-6)铵盐 对硝基苯磷酸盐(P-NPP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
显色反应
测定波长
橘红色 黄色 棕色 蓝绿色
492 450 449 642
第九章 酶免疫技术
三大经典标记技术 三大经典标记技术
发 光 免 疫 技 术
放 射 免 疫 技 术
酶 免 疫 技 术
第一节
酶免疫技术概述
酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）
作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的 高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测 技术 。 能定性、定位、定量
Ab+E Ab-E+Ag
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
AP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
双抗体夹心法
是检测抗原最常用的方法
原理：
将已知的特异性抗体包被微量反应板，
和待检抗原反应，再加酶标抗体和底物，
根据显色反应对抗原进行定性和定量。
1）将特异性抗体包被固相载体，形成固相抗体。
2）加待检血清（Ag）,待检抗原与固相抗体
发生特异性结合，经洗涤除去未结合成分。
3）加酶标记抗体，反应后形成固相抗体-待检 抗原-酶标记抗体的复合物。 4）加底物显色。 5 ）通过比色对待检抗原进行定性和定量。？
酶及其作用底物
（一）标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
酶及其作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要