9酶标记免疫技术

一、原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性

主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
二、酶免疫技术类型
组织切片或细胞标本 中抗原或抗体的定位
酶免疫组织化学技术 酶放大免疫测定技术 酶免疫分析技术 酶免疫测定技术 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
酶及其作用底物
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
2.碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯水解
酶，因其敏感性高，空白值低，常用于EIA。
Ab-E AgAb-E+底物
显色
一、原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应
特点：
灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法。
对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
洗涤
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
其所生成的颜色深浅与欲测的抗 原（抗体）含量成一定比例。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原
二、方法类型及反应原理
ELISA测定的三个 必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA方法类型
（一）双抗体夹心法 （二）双位点一步法 （三）竞争法 （四）间接法 （五）捕获法测IgM抗体
酶标记抗体或抗原
技术方法简单、产率高，重复性好
制备方法要求
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性 酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
制备方法
戊二醛交联法
第三节
酶联免疫吸附试验
(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶及其作用底物
常用底物
HRP的底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
1.辣根过氧化物酶（HRP）：应用最广泛，从 辣根菜中提取， 由糖蛋白和辅基构成，辅 基主要成分是亚铁血红素，是酶活性的中 心。 HRP的优点：分子量小，标记物易透入 细胞；标记方法简单；溶解性好； 价格低 且有商品供应；底物种类多。
方法评价
ELISA操作简单、快速、敏感性高、
特异性强、实验设备要求简单、应用范 围广泛、无放射性污染、能定性及半微
量、微量、超微量定量分析。
是目前应用最广，发展最快的酶免
疫学技术方法。
ELISA的基本原理 ELISA的技术类型和原理 各种ELISA技术方法的特点
一、基本原理
原理
1
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
8
酶免疫测定技术 （1）均相测定技术： 不需将结合的与游离的酶标记物分离， 即可测定IC。 （2）非均相测定技术： 抗原抗体反应后需将结合的与游离的酶 标记物分离后才能测定。 包括：液相法： 固相法：（最常用）
第二节
酶标记物的制备
一、酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原、半抗原在 交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的 关键试剂。 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应， 还具有酶促反应，显示出生物放大作用， 但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同 的颜色反应.
碱性磷酸酯酶
黄色 红色
400 500 360,450 420
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 荧光 苷酶 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate） 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
酶
辣根过氧化物 酶
底 物
邻苯二胺 四甲基联苯胺 5-氨基水杨酸 2,2‘-氨基-2(3-乙基-苯 并噻唑啉磺酸-6)铵盐 对硝基苯磷酸盐(P-NPP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
显色反应

测定波长
橘红色 黄色 棕色 蓝绿色
492 450 449 642
第九章 酶免疫技术
三大经典标记技术 三大经典标记技术
发 光 免 疫 技 术
放 射 免 疫 技 术
酶 免 疫 技 术
第一节
酶免疫技术概述
酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）
作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的 高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测 技术 。 能定性、定位、定量
Ab+E Ab-E+Ag
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
AP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
双抗体夹心法

是检测抗原最常用的方法
原理：
将已知的特异性抗体包被微量反应板，
和待检抗原反应，再加酶标抗体和底物，
根据显色反应对抗原进行定性和定量。
1）将特异性抗体包被固相载体，形成固相抗体。
2）加待检血清（Ag）,待检抗原与固相抗体
发生特异性结合，经洗涤除去未结合成分。
3）加酶标记抗体，反应后形成固相抗体-待检 抗原-酶标记抗体的复合物。 4）加底物显色。 5 ）通过比色对待检抗原进行定性和定量。？
酶及其作用底物
（一）标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
酶及其作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要