Southern 印迹杂交实验报告
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
Southern印迹杂交实验服务
Southern印迹杂交实验服务原理Southern 印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。
其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
【晶莱生物】实验流程1、制备待测DNA2、DNA限制酶消化3、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品4、电泳凝胶预处理5、转膜6、探针标记7、预杂交8、Southern杂交9、洗膜10、放射性自显影检测11、实验结果分析及报告客户提供1、待杂交目标基因序列和含有待杂交基因的阳性质粒（如自带引物，请提供引物：100umol/ul，〉10ul,冰袋运输）。
2、待杂交的高质量DNA样品质量至关重要，决定实验的成败，请确保DNA抽提质量，尽量采用进口试剂盒提取,A、基因组DNA检测：OD260/OD280=1.8-2.0，基因组要求DNA总量不小于10ug，浓度大于200ng/ul；B、请提供基因组DNA检测图片，要求无降解，无蛋白污染；C、检测样品低温运输至公司，或交给当地的业务员或代理商处理3、客户如果无法提供高品质的基因组DNA样品，本公司可以帮助制备可用于Southern Blot 检测的DNA样品，客户提供样品要求如下：A、菌液：不低于500ul，冰袋或者干冰运输B、组织：总量不小于100mg，干冰运输C、细胞：提供新鲜的细胞即可，尽量不要使用盐溶液冲洗4、请注明基因组DNA酶切方案，如果项目中需要用到非常规的限制性内切酶，需额外加收酶切费用或有客户提供相应的限制性内切酶。
终产品1、DNA样品检测报告（实验样品不返还，请注意保留备份）2、标准实验流程报告3、southern blot实验结果检测报告做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，勤劳的蜜蜂有糖吃细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
southern bloting
Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA 转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA 发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M 马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
（三）步骤：1、酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系30μl）ddH2O 5μl 基因组DNA（0.5μg/μl）2μl短暂离心，消除离心管内气泡，于37℃消化过夜注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
sourthern印迹法
sourthern印迹法摘要：一、Southern印迹法的原理二、Southern印迹法的实验步骤三、Southern印迹法的应用领域四、Southern印迹法的优缺点五、我国在Southern印迹法的研究与发展正文：一、Southern印迹法的原理Southern印迹法（Southern blotting）是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA分子中的特定序列。
该技术的核心原理是将DNA从凝胶转移到膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，从而检测目标DNA序列。
二、Southern印迹法的实验步骤1.制备样品：提取生物组织中的DNA，并进行纯化和定量。
2.电泳分离：将DNA样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量分离出不同的DNA片段。
3.转移：将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
4.杂交：将膜放入含有标记探针的杂交液中，让探针与目标DNA序列结合。
5.洗涤：去除未结合的探针，洗涤膜以消除非特异性信号。
6.检测：使用放射性自显影或化学发光法检测杂交信号，分析结果。
三、Southern印迹法的应用领域Southern印迹法广泛应用于基因mapping、基因突变检测、基因表达分析和病原体检测等领域。
在基因研究中，它可以确定基因的位置、大小和数量；在医学领域，可用于检测肿瘤基因、病原体基因等。
四、Southern印迹法的优缺点优点：具有较高的灵敏度和特异性，可以检测到微量的目标DNA序列。
缺点：实验操作复杂，耗时较长，对实验环境要求较高，且存在放射性污染风险。
五、我国在Southern印迹法的研究与发展我国科研人员在Southern印迹法的研究方面取得了丰硕的成果，不仅在基础研究中有广泛应用，还将其应用于农业、医学等领域。
为降低放射性污染，我国科研人员还研发了非放射性Southern印迹法，如化学发光法等。
在未来，我国将继续加大对Southern印迹法的研究力度，推动分子生物学技术的发展。
【结束语】通过本文的介绍，我们对Southern印迹法有了更深入的了解。
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交Southern印迹杂交实验原理核酸分⼦杂交技术是分⼦⽣物学领域中最常⽤的具体⽅法之⼀。
其基本原理是：具有⼀定同源性的两条核酸单链在⼀定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是⾼度特异的。
由于核酸分⼦的⾼度特异性及检测⽅法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分⼦的限制图谱。
但为了进⼀步构建出DNA分⼦的遗传图，或进⾏⽬的基因序列的测定以满⾜基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分⼦中基因编码区的⼤⼩和位置。
有关这类数据资料可应⽤Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：⼀是将待测定核酸分⼦通过⼀定的⽅法转移并结合到⼀定的固相⽀持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;⼆是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在⼀定的温度和离⼦强度下退⽕，即分⼦杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡⼤学的E.M.Southern⾸创的，Southern印迹杂交故因此⽽得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经⽑细管的虹吸作⽤，转移到硝酸纤维膜上。
近年来印迹⽅法和固定⽀持滤膜都有了很⼤的改进，印迹⽅法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如AP T、ABM纤维素膜）等。
利⽤Southern印迹法可进⾏克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某⼀基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性⽚断长度多态性分析（RFLP）等。
实验⽅法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
⼀、待测核酸样品的制备（⼀）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。
1. 采⽤适当的化学试剂裂解细胞，或者⽤组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. ⽤蛋⽩酶和RNA酶消化⼤部分蛋⽩质和RNA；3. ⽤有机试剂（酚/氯仿）抽提⽅法去除蛋⽩质。
（⼆）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成⼤⼩不同的⽚段之后才能⽤于杂交分析，通常⽤限制酶消化DNA。
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。
有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。
近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。
利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。
1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。
Nouthern杂交实验
实验五十五 Nouthern杂交【实验原理】Northern杂交是研究真核细胞基因表达的基本方法。
与Southern印迹杂交相对应，故被称为Northern印迹杂交。
Northern杂交是用来检测真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法，可从大量的RNA样本中同时获得这些信息。
这是其它实验方法无法比拟的。
其基本原理是通过变性琼脂糖凝胶电泳将RNA样品进行分离，再转移到尼龙膜等固相膜载体上，用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的RNA进行杂交，洗膜去除非特异性杂交信号，经放射自显影，对杂交信号进行分析。
将杂交的mRNA分子在电泳中的迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中待定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知道该基因表达mRNA的强弱。
【实验用品】（一）器材电泳仪，电泳槽，恒温水浴箱，恒温干烤箱，同位素探测仪，自动光密度扫描仪，核酸转移装置，紫外照相装置，X光胶片盒(带增感屏)，1.5ml、0.5ml离心管，移液器，玻璃刻度吸管(1ml、5ml、10ml)，塑料封口机，紫外检测仪。
（二）试剂1．5×甲醛凝胶电泳缓冲液0.1mol/L 3-[N—玛琳代]丙磺酸MOPS(PH 7.0) 40 mmol/L NaAC 5 mmol/L EDTA(PH 8.0)将20.6gMOPS溶于800ml经0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的50 mmol/L乙酸钠溶液。
用2 mol/L NaoH将溶液的PH调至7.0，加10ml用DEPC处理的0.5 mol/L EDTA(PH 8.0)，用DEPC处理的三蒸水补足溶液总体积为l L。
上述溶液用0.2µmol 微孔滤膜过滤除菌，避光保存于4℃。
溶液见光变为深黄色不能再用。
2．甲醛凝胶加样缓冲液50％甘油 1mmol/L EDTA(PH8.0) 0.25％溴酚蓝用0.1％DEPC 37℃处理过夜．高压灭菌，保存与室温。
Southern杂交实验
Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
Southern_blot实验方法与步骤
实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。
四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。
Southern印迹杂交实验原理和方法-3
Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。
但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。
下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。
探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。
探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。
以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。
室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。
由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。
因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。
Southern杂交
实验九Southern 印迹杂交目的要求：了解核酸Southern印迹杂交的原理及其操作过程。
核酸杂交原理：核酸分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。
其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的两条多核苷酸链,按碱基配对原则形成稳定的双链分子。
若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。
探针与其互补的的核苷酸序列杂交后杂交体也就带上了同样的标记，可被检测出来。
这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。
核酸分子杂交分为两类，即Southern杂交和Northern杂交。
Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，常用于外源基因整合的鉴定及分析。
Northern杂交是以DNA 或RNA为探针，检测RNA链，常用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。
Southern 杂交是研究DNA物理图谱的基本技术，在DNA遗传诊断及PCR产物分析等方面有重要应用。
Southern印迹杂交基本方法是将DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下将DNA从凝胶中转印至膜上，烘干固定后即可用于杂交。
凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与标记的探针杂交，利用放射自显影术或其它显影技术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
实验材料和试剂：变性缓冲液：1.5M NaCl 0.5M NaOH中和缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH8.0) 1.5M NaCl20×SSC：3 M NaCl 0.3M柠檬酸钠pH7.0待检PCR DNA样品实验操作步骤：DNA 凝胶电泳和转膜1.配制0.8% 的琼脂糖凝胶，3-4V/cm电压电泳。
Southern印迹杂交实验原理和方法-2
Southern印迹杂交实验原理和方法-2（一）细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：1．20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2．凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3．照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5．尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
7．以下方法把DNA固定在膜上：（1）紫外交联：1）把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上2）把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟。
3）在无菌双蒸水中浸润膜。
4）空气中凉干膜。
（2）干燥：1）在2×SCC中短暂洗膜。
2）120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。
图 10-1细管虹吸印记法（二）电转移法此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。
其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。
在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。
该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。
Southern杂交
Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。
（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。
Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。
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Southern 印迹杂交实验报告
姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生
实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤
【实验目的】
学习核酸杂交的基本过程和操作
【实验原理】
将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】
1、基因组DNA的限制性内切酶酶切
取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳
先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）
②基因组DNA10 μg（老师的）
③酶切样品
④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)
⑤酶切样品
⑥基因组DNA10 μg （老师的）
⑦基因组DNA10 20μl （自己的）
插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
3、变性
切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）
①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。
②ddH2O洗2次。
③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
4、转移
①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。
②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。
③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。
④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的
滤纸，赶走气泡。
⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。
⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。
保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。
⑦用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。
取走滤纸上的
保鲜膜。
⑧整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10 cm。
⑨在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。
5、固定
①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。
②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。
6、杂交和洗膜
①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。
②倒出预杂交液, 加杂交液，68℃杂交过夜。
③回收杂交液（可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。
④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。
7、检测
①将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。
②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。
③在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。
④用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。
⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。
⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。
⑦当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE或ddH2O洗去底物液，拍照并干
燥保存。
【实验结果】
上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和Southern blot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显示1-3条带（基因组DNA自己的；基因组DNA老师的；酶切样品）均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示，1、2条带因为基因组很大，在电场作用下基本不会动，故在靠近加样孔的地方；而酶切后的基因组由于断裂成一系列的片段，电泳时会形成均匀的涂抹状，见条带3；尾巴高亮怀疑是RNA量过多；Southern blot 只显示了阳性对照结果。
【注意事项】
1、DNA限制性酶的用量1-5U/ugDNA，时间为1-20小时。
中途可取少量（小于十分之一）电泳检测是否酶切完全。
2、EDTA会抑制酶活性，在酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。
3、内切酶一般保存在甘油中，甘油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体积的十分之一，否则应将反应体积加大。
4、若基因组DNA浓度低，可在酶切后用一冲成点浓缩DNA后跑胶。
5、标记探针在加入杂交液之前，一定要加热变性处理，并且要先在杂交液中混匀后加入，不要直接加在膜上。
6、杂交也可以在杂交袋中进行。
7、含有DIG标记探针的杂交液可以放在-20°C保存，反复多次使用，每次用前在68°C热变性。
8、为了获得最佳效果，第一次使用的探针，可做系列模拟杂交，即将小块尼龙膜在不同探针浓度的杂交液中杂交过夜，然后经显色检测，采用背景可以接受的最高的探针浓度进行真实杂交。
9、第一次杂交的DNA可用碱去除探针（限于尼龙膜），用第二个探针做预杂交和杂交。
10、杂交的灵敏度取决于杂交液中探针的弄得和显色时间。
11、对于尼龙膜可采用碱溶液转移，更有利于DNA的结合。
12、若目的片段大于10kb可用0.25mol/lHCl先部分脱嘌呤，使片段变短，便于有效转移。
【讨论】
●结果分析
本实验凝胶电泳后，紫外灯下观察1-3条带均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示。
转膜结果中只有阳性对照组有杂交后显色，可能原因有：①本实验采用毛细管法向上转移，可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全，使DNA含量非常少，以至于无法抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色；②DNA含量过少，非放射性标记探针法灵敏度不高，可以试用放射性探针标记法提高灵敏度；③预杂交液封闭非特异性结合位点时也结合了含量很低的待测DNA位点，可以尝试用不同浓度的预杂交液来封闭非特异性位点；④洗膜条件有：低严格度（低温、高盐）、高严格度（高温、低盐），随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以洗膜时一定要按照低严格度→高严格度，可以减少DNA的流失。
●影响杂交的因素：
1、待检核酸分子的浓度和长度，浓度越大，复性速度越快，敏感性越高；分子越大，转膜越困难，敏感性下降。
2、探针的性质（标记效率、浓度，核酸性质）：对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；探针标记方法和检测方法的选择。
进行探针标记的标记物分两大类：放射性和非放射性。
放射性标记物的灵敏度极高，可检测到10-14—10-18g的物质，在最适条件下，可检测出样品中少于1000个分子的核酸含量，但是存在着放射性污染及放射核素发生衰变所产生的不稳定性两大缺点。
非放射性标记物（生物素、地高辛、荧光物质、酶类、金属Hg等）优点是无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放等。
本实验采用地高辛连接于dUTP上进行标记，地高辛标记的探针与靶核酸杂交后，用带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行免疫结合反应，通过酶底物的化学显色来显示。
与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可以长期保存。
与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。
3、杂交液体积、温度和杂交时间：体积越小，杂交动力学越高；DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃；温度↓非特异性↑；温度↑敏感性↓。
4、杂交液的离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的杂交时，必须维持
杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。
5、非特异性杂交反应：预杂交的作用，杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异吸附。
常用的封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA，②高分子化合物：脱脂奶粉等。
6、杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数，体积；漂洗从低严谨度（低温高盐）→高严谨度（高温低盐）。
7、固相膜的选择：阳离子尼龙膜。
8、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42°C。
使用甲酰胺的优点：低温下探针更稳定，能更好地保留非共价结合的核酸。