光谱分析技术

光的显色原理
若把某两种颜色的光，按一定的强度比例 混合，能够得到白色光，则这两种颜色的 光叫做互补色。图中处于直线关系的两种 光为互补色。如绿光和紫光为互补色， 黄光和蓝光为互补色等等。
各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是 溶液中有色质点（分子或离子）选择性地 吸收某种颜色的光。
实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应 重新绘制。 （2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将样本稀释后再 测定。 （4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
2．对比法（标准对照法）
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
什么是光谱分析技术？
光的波长（λ） 单位用纳米（nm） 各种化学物质都具有一定的光谱特性，表现在能选择性吸收、 发射或散射某种波长的光。利用物质的吸收光谱、发射光谱 或散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术称为光谱 分析技术。
光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光的互补色。如一束白光通过高 锰酸钾溶液时，绿光大部分被选 择吸收，其它的光透过溶液。从 互补色示意图可以看出， 透过光 中只剩下紫色光，所以高锰酸钾 溶液呈紫色。
（二）光的吸收定律
溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可 以用吸收定律来描述。它是由约 翰· 海 因里希· 朗伯和奥古斯特· 比尔相结合 而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原 子吸收分光光度计也符合这个定律。
特点：
具有灵敏度高、干扰较少、选择性好、操作简便、快速、结果准确、可靠、 应用范围广、仪器比较简单、价格较低廉等优点，而且可以使整个操作自动 化，因此近年来发展迅速，是应用广泛的一种仪器分析新技术。
方法：
在温度吸收光程，进样方式等实验条件固定时，样品产生的待测元素相基态 原子对作为锐线光源的该元素的空心阴极灯所辐射的单色光产生吸收，其吸 光度（A）与样品中该元素的浓度（C）成正比。即 A=KC 式中，K为常数。 据此，通过测量标准溶液及未知溶液的吸光度，又巳知标准溶液浓度，可作 标准曲线，求得未知液中待测元素浓度。
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
分光光度计的基本结构
可见光光度计 721、721-A、722、723型 分光光度计等 紫外分光光度计 751、752、753型分光光度 计等
紫外-可见分光光度计 贝克曼DU500系列紫外/分 光光度计
吸光（消光）系数表达式
学习目标
• 掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收 系数法、比浊法测定的方法原理，在 生化检验中的应用及注意事项；区带 电泳的原理、应用及影响因素；离子 选择性电极法测定的原理和注意事项。 • 熟悉离心技术，其它电泳技术和层析 技术中的HPLC及亲和层析的原理和 应用；免疫分析技术、生物传感技术 的概念和应用原理。 • 了解色谱、层析等常用生化技术的应 用原理和方法，生物芯片技术的概念 和应用原理

一、仪器基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示
可见分光光度计
722型分光光度计示意图
722型分光光度计使用方法
（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光 电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切 断。 （2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。 （3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度 较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏 度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。 （4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”（此时试样室是打开的）。 （5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中 的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使 数字显示正好为“100.0”。 （6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调 节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿 座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光 路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断 光路。重复上述测定操作1～2次，读取相应的吸光度值，取平均值。 （7）浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋 钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测 溶液的浓度值。 （8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。
溶液对光的吸收 当一束强度为I的平 行单色光照到溶液时，一部分光被溶 液吸收，一部分光被界面散射，其余 的光则透过溶液，如图所示
结论：
I0=I a+ I r+ I t
I0--入射光强度 I a--吸收光强度 I r--反射光强度 I t--透射光强度 通常由于I r很小可忽略不计，上式可简化为 I0=I a+ I t 透射光I t与入射光强度I0之比为透光率或透 光度，用T表示： T= I t/ I 0 透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光 度，用A表示： A=－lgT=lg1/T=lgI 0/ I t
注意事项
（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打 开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。 （2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而 不能碰比色皿的光学表面。 （3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不 能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜 纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的 光学表面。
特点：
灵敏度更高 选择性强 使用简便
课后习题
选择： 1.可见光谱区的波长范围（ ） A.200~300nm B.300~400nm C.400~600nm D.400~760nm E.700~1000nm 2.分光光度法测定中制作标准曲线广泛采用的曲线图形为（ ） A.T-C曲线 B.IgT-C曲线 C.A-C曲线 D.A-λ曲线 E.以上都不对 3.某物质溶液吸收光谱曲线上最大吸收峰所对应的波长，称为该物质的（ A.特殊波长 B.最大吸收波长 C.最小吸收波长 D.综合波长 E.以上都不对 名词解释 什么是光谱分析技术？ 什么是吸光度？ 什么是吸光系数？
应用：
主要适用样品中微量及痕量组分分析。
荧光分析法
定义：
利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以 进行定性或定量分析的方法。
原理：
物质的分子吸收紫外光或可见光后，由电子基态能级跃迁至激发态能级。 处于激发态的分子不稳定，通过各种方式失去能量，返回基态。若分子首 先通过碰撞和系统内转换等方式失去部分能量，下降至电子第一激发态的 最低振动能级，然后再发射一定波长的光返回电子基态的任一振动能级， 则被发射的光称为荧光。显然，荧光的能量小于激发光能量，波长则长于 激发光。荧光的平均寿命很短，除去激发光源，荧光立即熄灭。
吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示 入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。
实验证明：单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度 有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。 其规律可用下式表示为 A＝KCL
式中： A——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K——某溶液的消光（吸收）系数； C——溶液的浓度； L——光程，即溶液的厚度。
是能的一种表现形式，是电 磁波的一种。光在真空中以直 线方式传播，在不同的介质处 发生反射、折射、衍射、色散、 干涉和偏振等现象。可用波长、 频率、传播速度等参量来描述 即光具有“波动性”。光的颜 色 即由光的波长决定，人眼能感 觉到的光称为可见光，其波长 在400～750nm之间。在可见 光之外是 红外光760~1000nm 紫外光200~400nm
吸光系数 A a表示 a = C（g/L）.L(cm) 单位 L/g.cm 摩尔消光系数 A ε表示 ε = C（mol/L）.L(cm) 单位 L/mol.cm 百分消光系数 A E 表示 E = C（g/dl）.L(cm) 单位是dL/(g.cm) 摩尔消光系数与百分消光系数的换算关系： ε = E * M（摩尔质量）
光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、荧光法 吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度法 散射光谱分析技术：比浊法
一、分光光度技术的基本原理
许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生 成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小， 颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液 的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液 进行定量分析的方法称为比色分析法。 光子的能量与波长的关系为 E=hυ= hc／λ 式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×1034J·S），c为光速，λ为光的波长 因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。
影响因素：
1.悬浊液的散射光强度主要和颗粒的数量有关 2.注意掌握反应温度 3.溶液的PH值可影响沉淀的形成及颗粒的大小 4.悬浊液的稳定性较差，需及时比浊 5.稀释缓冲液中的电解质与非电解质对免疫复合物的形成和稳定性有影响 6.适当选择滤光片或入射光波长
原子吸收分光光度法
原理:
又称原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中待测元素的基态原子对其共振辐射 的吸收强度来测定试样中该元素含量的一种仪器分析方法。它是测定痕量和 超痕量元素的有效方法。