【培训课件-临床基因组学】_第七章 Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学
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临床基因组学：第七章-第3讲 Sanger测序及高通量测序技术
• 2012年，《自然》杂志报道了1092个人类基因组序列。
• NHLBI Cohort (ESP6500)
• NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 • 6503个样本：
• 2203 African-Americans • 4300 European-Americans
遗传病的基因突变
微小突变
苯丙酮尿症 甲基丙二酸血症 肝豆状核变性 RETT综合征
residue where a
established
where LOF is a
different pathogenic pathogenic variant known
missense change has PS1
• 起始密码子(Met1)变异：
• P.Met1？
• 缺失变异（deletions）
• p.Gln8del • p.Gly4_Gln6del
• 重复突变（duplications）
• p.Gln8dup • p.Gly4_Gln6dup
• 无义突变
• P.Trp26X
• 插入变异（insertions） • p.Lys2_Leu3insGlnSer
计算机 预测
Multiple lines of computational Multiple lines of
evidence suggest no impact on Computational
gene/gene product BP4
evidence support a
deleterious effect on
Variant impact on gene, transcript, protein sequence
Sequence conservation Phylogenetic and structural characteristics
• NHLBI Cohort (ESP6500)
• NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 • 6503个样本：
• 2203 African-Americans • 4300 European-Americans
遗传病的基因突变
微小突变
苯丙酮尿症 甲基丙二酸血症 肝豆状核变性 RETT综合征
residue where a
established
where LOF is a
different pathogenic pathogenic variant known
missense change has PS1
• 起始密码子(Met1)变异：
• P.Met1？
• 缺失变异（deletions）
• p.Gln8del • p.Gly4_Gln6del
• 重复突变（duplications）
• p.Gln8dup • p.Gly4_Gln6dup
• 无义突变
• P.Trp26X
• 插入变异（insertions） • p.Lys2_Leu3insGlnSer
计算机 预测
Multiple lines of computational Multiple lines of
evidence suggest no impact on Computational
gene/gene product BP4
evidence support a
deleterious effect on
Variant impact on gene, transcript, protein sequence
Sequence conservation Phylogenetic and structural characteristics
生物技术：基因测序与基因组编辑技术讲解培训ppt
测序速度更快
01
随着技术的不断进步，基因测序的速度将越来越快，能够更快
地完成大规模的基因组测序。
测序成本更低
02
随着技术的成熟和规模化生产，基因测序的成本将逐渐降低，
使得更多人能够享受到基因测序带来的益处。
测序精度更高
03
未来基因测序的精度将越来越高，能够更准确地检测出基因变
异和疾病相关基因。
基因组编辑技术的发展趋势
技术更加成熟
目前基因组编辑技术已经取得了一定的成果，未来技术将 更加成熟，能够更加精准地实现对基因组的编辑。
应用范围更广
基因组编辑技术的应用范围将越来越广，不仅局限于治疗 遗传性疾病和传染病，还将拓展到农业、生物多样性保护 等领域。
伦理和法律问题需关注
随着基因组编辑技术的广泛应用，相关的伦理和法律问题 也将引起更多关注，需要制定相应的规范和标准来保障技 术的合理应用。
在农业领域，基因组编辑技术可以用于改良作物的性状，提高其抗逆性和产量等。
在基础科学研究领域，基因组编辑技术可以用于研究基因的功能和调控机制等。
基因组编辑技术的优缺点
基因组编辑技术的优点包括
精确度高、操作简单、适用范围广等。该技术能够精确地修改生物体的基因组，从而达到治疗疾病或改良物种的 目的。同时，基因组编辑技术操作简单，易于实现自动化和标准化。此外，该技术的应用范围非常广泛，可以应 用于各种生物研究和医学治疗中。
生物技术：基因测序与基因 组编辑技术讲解培训
汇报人：可编辑 2023-12-23
目录
• 生物技术概述 • 基因测序技术 • 基因组编辑技术 • 基因测序与基因组编辑技术的应用案例 • 展望未来生物技术发展
01
生物技术概述
Sanger测序的基本原理、过程及注意事项
Sanger测序的基本原理、过程及
热烈欢迎注莅意事临项参观指导
内容提要
一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题
5’ 磷酸
3',5'-磷酸二酯键
脱氧核糖核苷酸通过形成3’，5’-磷酸二酯键延长DNA的链
化学原理：双脱氧末端终止法 无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入
谢谢！
大约2小时
测序PCR产物的纯化
大约1小时40分钟
上机进行测序分析
ExoSAP-IT 酶纯化
ExoSAP-IT酶是一种复合酶，包括两种水解酶：外切酶 Exonuclease I 和虾碱性磷酸酶
虾碱性磷酸酶
残留的引物及任何在PCR 中产生的外来单链DNA
Exonuclease I
配制测序PCR体系&进行测序PCR反应
注意事项
1、ExoSAP-IT 酶/BigDye/HiDi必须在-20℃保存，使用ExoSAP-IT 酶时需要用冰盒，而且要防 止剧烈震荡，BigDye/HiDi最好是分装保存在-20℃； 2、进行测序PCR加样本时，必须要加到样本DNA及测序引物； 3、测序纯化时，一定要用-20℃预冷的70%的酒精； 4、在测序纯化倒转离心的时候，离心的速度不能太快并且离心的时间不能过长，防止小片 段的丢失； 5、最后一步必须要把酒精充分的晾干，防止酒精峰干扰； 6、要更换新的POP7/POP4胶前，要把胶提前30min放到室温，并且把胶的封口膜撕开，换 完新的胶后必须要进行一步排气泡的操作，防止气泡进入毛细管中； 7、定时对仪器进行清洁/保养/校准。
拖尾峰- 可能需要更换毛细管
四种颜色都出现拖尾峰通常是毛细管损坏最初的信号，表明需要更换毛细 管。 也可能是pH变化、氧化、温度变化或者是暴露在光下造成的。
热烈欢迎注莅意事临项参观指导
内容提要
一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题
5’ 磷酸
3',5'-磷酸二酯键
脱氧核糖核苷酸通过形成3’，5’-磷酸二酯键延长DNA的链
化学原理：双脱氧末端终止法 无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入
谢谢！
大约2小时
测序PCR产物的纯化
大约1小时40分钟
上机进行测序分析
ExoSAP-IT 酶纯化
ExoSAP-IT酶是一种复合酶，包括两种水解酶：外切酶 Exonuclease I 和虾碱性磷酸酶
虾碱性磷酸酶
残留的引物及任何在PCR 中产生的外来单链DNA
Exonuclease I
配制测序PCR体系&进行测序PCR反应
注意事项
1、ExoSAP-IT 酶/BigDye/HiDi必须在-20℃保存，使用ExoSAP-IT 酶时需要用冰盒，而且要防 止剧烈震荡，BigDye/HiDi最好是分装保存在-20℃； 2、进行测序PCR加样本时，必须要加到样本DNA及测序引物； 3、测序纯化时，一定要用-20℃预冷的70%的酒精； 4、在测序纯化倒转离心的时候，离心的速度不能太快并且离心的时间不能过长，防止小片 段的丢失； 5、最后一步必须要把酒精充分的晾干，防止酒精峰干扰； 6、要更换新的POP7/POP4胶前，要把胶提前30min放到室温，并且把胶的封口膜撕开，换 完新的胶后必须要进行一步排气泡的操作，防止气泡进入毛细管中； 7、定时对仪器进行清洁/保养/校准。
拖尾峰- 可能需要更换毛细管
四种颜色都出现拖尾峰通常是毛细管损坏最初的信号，表明需要更换毛细 管。 也可能是pH变化、氧化、温度变化或者是暴露在光下造成的。
生物技术：基因测序与基因组编辑技术讲解培训ppt
VS
详细描述
这些技术各有特点，适用于不同的基因组 编辑需求。例如，基于人工核酸酶的基因 组编辑技术包括人工核酸酶和DNA修复 酶的组合应用，可以实现更加精确和高效 的基因组编辑。基于DNA同源重组的基 因组编辑技术则适用于对精确度要求较高 的基因组编辑实验，如基因敲入等。
05
CATALOGUE
基因测序与基因组编辑技术的 应用案例
详细描述
TALENs由多个氨基酸模块组成，每个模块能够识别一个DNA碱基，从而实现特异性的 DNA序列识别。TALENs技术已经广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因激活等基因组
编辑实验。
CRISPR-Cas9系统
总结词
一种基于细菌免疫系统的基因组编辑技术， 通过RNA指导的Cas9蛋白识别并切割DNA 序列。
生物技术：基因测序与基 因组编辑技术讲解培训
汇报人：可编辑
2023-12-23
CATALOGUE
目 录
• 基因测序技术概述 • 基因测序技术分类 • 基因组编辑技术概述 • 基因组编辑技术分类 • 基因测序与基因组编辑技术的应用
案例 • 基因测序与基因组编辑技术的挑战
与前景
01
CATALOGUE
基因测序技术可以用于生物进化研究 中，通过对不同物种的基因序列进行 比较，揭示生物的进化历程和演化机 制。
药物研发
基因测序技术可以用于药物研发过程 中，通过对药物作用靶点的基因序列 进行分析，提高药物的研发效率和针 对性。
基因测序技术的发展历程
1970年代
基因测序技术的雏形出现，主 要是通过化学降解法测定DNA
基因组编辑技术的原理
基因组编辑技术主要基于CRISPR-Cas9系统，通过向导RNA的引导，Cas9核酸酶能够精准地切割目 标DNA序列，从而实现基因组的编辑。
高通量测序基础学习培训
富集的外泌体
• 干冰运输即可。也可以送4ml左右血浆或血清， 我们来富集。
1. 一般每组至少3个样本
2. 取样的代表性及准确性
• 取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致 • 准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输进行实验处
理
3. 样本编号
• 比如：癌症病人组可用编号 C_01； C_02； C_03……；正常病人组可用 编号 N_01； N_02
2） 2100 bioanalyzer检测片段大小：其峰值大小应该是目的片段大 小加上接头的序列长度。
示例1 2100 bioana分析
• 数据质控和筛选过滤，得到高质量数据 • 根据不同的测序类型进行差异基因分析、功能注
释、预测新的基因等
• 判断是否存在降解应以2100 bioanalyzer模拟电泳图为准 • 植物样品检测结果为 25S/18S ，具有相同的参考意义
RIN值 浓度、总量
• RNA Intergrity Number，RNA完整性指数，满分为10分 • 建议使用符合RIN值≥ 7且rRNA 28S/18S≥ 0.7
• 起始总RNA浓度≥ 100 ng/µl • 起始总RNA量 ≥ 2 µg/样品（如小RNA测序） • 或起始总RNA量 ≥ 20 µg/样品（如转录组测序）
示例1 2100 bioanalyzer峰图和模拟电泳图
示例2
（报告一）
样序列打 碎成200-500bp的
小片采用特异性染料结合的方式特异性的检测样本浓度 来实现精确定量。
主要测序平台
Illumina 高通量测序平台，主要由HiSeq测序仪和MiSeq测序仪组成。
HiSeq 2500平台
• 转录组测序、小RNA测序
Sanger测序原理
未来发展方向
未来发展方向
未来技术改进
未来应用领域
随着技术的不断进步，Sanger 测序的未来发展方向包括提高 测序速度、降低成本和提高分 辨率。此外，开发能够同时进 行DNA和RNA测序的多模式测 序技术也是未来的一个重要趋 势。
未来Sanger测序技术的改进可 能包括改进荧光染料和检测系 统以提高分辨率，开发新型聚 合酶以降低误差率，以及开发 能够同时进行多路测序的微流 体芯片和纳米孔测序技术。
成本较低
随着技术的不断改进，Sanger测序的 成本逐渐降低，使得更多研究机构和 个人能够承担测序费用。
缺点
速度慢
Sanger测序技术的速度相对较慢， 对于大规模基因组测序存在一定 的限制。
成本高
虽然Sanger测序技术成本相对较 低，但对于大规模基因组测序来 说仍然较高，需要更多的资金支 持。
无法检测基因突变
02
03
合成引物
根据待测DNA序列，设计 并合成测序引物，用于引 导DNA聚合酶合成互补链。
合成互补链
使用DNA聚合酶，根据引 物的引导，合成与待测 DNA互补的链。
标记终止子
在合成互补链的过程中， 引入标记终止子，以便后 续的检测和识别。
聚合酶链式反应（PCR）扩增
设计PCR引物
根据待测DNA序列，设计PCR引物，用于扩增待测DNA片段。
电泳分离
经过凝胶电泳分离后，根据各个DNA片段的长度差异，可以确定每个碱基的位置，从而 确定整个DNA序列。
应用领域
基因组学
01
用于测定基因组中所有基因的序列，研究基因组的变异和进化。
分子生物学
02
用于研究基因表达、转录和翻译等过程，以及蛋白质的结构和
临床医学技术培训PPT高通量测序与临床诊断
肿瘤基因突变背景
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
高通量测序技术及原理介绍ppt课件
Bustard
• Base with highest corrected intensity is called
AC
G
T
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
C
Gerald
• Filtering removes low quality base calls
GEneration of Recursive Analyses Linked by
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
1-8 samples
Fragment DNA Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters Select ligated DNA
Hybridize to flow cell Extend hybridized oligos Perform bridge amplification
Solexa
Flow cell in GAIIx
Image re-analysis pipleline
Instrument PC
Images (.tif) Lane 1..8
Cycle 1..36
Tile_Cycle_Image_a, Tile_Cycle_Image_c, Tile_Cycle_Image_g, Tile_Cycle_Image_t
生物技术：基因测序与基因组编辑技术讲解培训ppt
食品领域
生物技术在食品领域的应用包括食品加工、 食品安全检测、功能食品等。
环保领域
生物技术在环保领域的应用包括废水处理、 固体废弃物处理、环境监测等。
02
基因测序技术原理与流程
基因测序技术的基本原理
下一代测序技术
基于聚合酶链式反应（PCR）和/或连接酶链式反应（LCR）原理，通过大量扩增目标DNA片段并对其进行测序 。
基因组编辑技术在医学领域的应用案例分析
01
02
03
罕见病治疗
利用基因组编辑技术修复 致病基因，治疗罕见病和 遗传病。
免疫疗法
通过编辑患者的免疫细胞 ，增强其对肿瘤细胞的攻 击能力。
农业改良
基因组编辑可用于改良农 作物，提高产量、抗病性 和抗逆性。
两种技术在医学领域的综合应用前景
精准医疗
结合基因测序和基因组编 辑技术，实现个性化、精 准化的医疗方案。
基因测序技术能够全面地分析生物体的基因组，发现新的基因和功能，为药物研发和生物技术应用提供 支持。
基因测序技术的优缺点比较
• 基因测序技术能够实时、快速、准确地检 测生物体的基因变化，为疾病预防和控制 提供帮助。
基因测序技术的优缺点比较
基因测序技术的成本较高，限制了其在临床和 科研领域的应用。
基因测序技术在解读基因序列时可能存在误差或遗漏 ，需要结合其他技术进行验证和补充。
法律监管
基因组编辑技术可能涉及人类尊 严和自由的问题，需要尊重个人 自主权和自由意志。
基因组编辑技术需要遵守相关法 律法规，确保技术的合法性和规 范性。
如何合理利用两种技术，促进人类健康与发展
建立伦理准则
制定并遵守相关的伦理准则，确保技术的合理应 用。
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识ppt课件
推动跨学科合作
鼓励微生物学、遗传学、临床医学等相关领域的专家加强跨学科合作， 共同推动高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的临床应用和研 究进展。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
样本质量
01
样本采集和处理环节对测序结果至关重要，需要严格
控制样本质量，避免污染和误差。
数据分析
02 高通量测序产生的数据量庞大，需要建立完善的数据
分析流程和标准，确保结果的准确性和可靠性。
技术更新
03
随着测序技术的不断发展和进步，需要保持对新技术
的关注和应用，不断提高检测水平和效率。
06 总结和展望
02 高通量宏基因组测序技术 在实验室的应用
样本收集和处理
样本选择
选择适当的临床样本，如血液、 尿液、呼吸道分泌物等，根据患 者的症状和疑似病原体进行针对
性收集。
样本处理
对收集到的样本进行适当的处理 ，如离心、过滤等，以去除杂质
和富集病原微生物。
核酸提取
采用合适的核酸提取方法，如磁 珠法、柱层析法等，提取样本中
未来高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的潜力 和前景
技术迭代升级
随着技术的不断发展，未来高通量宏基 因组测序技术的检测精度、效率和成本 等方面将持续优化，为病原微生物检测 提供更加可靠的技术支持。
VS
多组学联合分析
宏基因组测序技术可以与其他组学技术（ 如代谢组学、蛋白质组学等）进行联合分 析，深入挖掘病原微生物与宿主之间的相 互作用机制，为临床诊断和治疗提供更加 全面的信息。
05 案例分析和经验教训
案例介绍
案例背景
01
介绍某疫情的情况，包括疫情规模、影响范围、病原微生物特
鼓励微生物学、遗传学、临床医学等相关领域的专家加强跨学科合作， 共同推动高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的临床应用和研 究进展。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
样本质量
01
样本采集和处理环节对测序结果至关重要，需要严格
控制样本质量，避免污染和误差。
数据分析
02 高通量测序产生的数据量庞大，需要建立完善的数据
分析流程和标准，确保结果的准确性和可靠性。
技术更新
03
随着测序技术的不断发展和进步，需要保持对新技术
的关注和应用，不断提高检测水平和效率。
06 总结和展望
02 高通量宏基因组测序技术 在实验室的应用
样本收集和处理
样本选择
选择适当的临床样本，如血液、 尿液、呼吸道分泌物等，根据患 者的症状和疑似病原体进行针对
性收集。
样本处理
对收集到的样本进行适当的处理 ，如离心、过滤等，以去除杂质
和富集病原微生物。
核酸提取
采用合适的核酸提取方法，如磁 珠法、柱层析法等，提取样本中
未来高通量宏基因组测序技术在病原微生物检测中的潜力 和前景
技术迭代升级
随着技术的不断发展，未来高通量宏基 因组测序技术的检测精度、效率和成本 等方面将持续优化，为病原微生物检测 提供更加可靠的技术支持。
VS
多组学联合分析
宏基因组测序技术可以与其他组学技术（ 如代谢组学、蛋白质组学等）进行联合分 析，深入挖掘病原微生物与宿主之间的相 互作用机制，为临床诊断和治疗提供更加 全面的信息。
05 案例分析和经验教训
案例介绍
案例背景
01
介绍某疫情的情况，包括疫情规模、影响范围、病原微生物特
高通量测序技术的类型原理及应用-ppt
纳米孔测序原理
概述
纳米孔测序技术利用电 场驱动DNA通过纳米孔， 通过检测电流变化来判 断DNA序列。
原理
DNA通过纳米孔时，不 同碱基对产生的电学信 号不同，根据信号差异 进行测序。
特点
单分子测序、实时检测、 便携式，适用于单分子 水平的基因组测序和变 异检测。
合成测序原理
概述
合成测序技术是通过连续添加碱基并检测产物来推断DNA 序列的技术。
特点
高通量测序技术具有高速度、高 准确性、高灵敏度、高通量和高 信息量等特点，能够快速获取大 量基因组序列信息。
高通量测序技术的发展历程
1977年
01
1986年
02
03
1990年
Sanger等提出DNA测序方法， 即双脱氧终止法，奠定了DNA测 序的基础。
Maxam和Gilbert提出另一种测 序方法，即化学降解法。
微生物多样性研究
高通量测序技术可以测定微生物群落的基因组序列，有助于研究微 生物多样性和生态学。
农业与动植物研究
作物育种与改良
高通量测序技术可以测定作物的基因组序列，为 作物育种和改良提供技术支持。
动物遗传资源保护
高通量测序技术可以检测动物的遗传变异，有助 于动物遗传资源的保护和评估。
生态学与进化研究
原理
合成过程中加入不同碱基的类似物，通过检测产物中特定 碱基的量来确定DNA序列。
特点
高精度、高分辨率、低成本，适用于基因组测序和SNP检 测。
光学图谱测序原理
概述
光学图谱测序技术利用光学显微镜和 分子标记技术对DNA进行定位和测
序。
原理
在DNA分子上标记荧光染料或量子 点等光学标记，通过光学显微镜观察
【培训课件-临床基因组学】_临床基因组学-Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学
Applied Biosystems® 3730系列基因分析仪
Applied Biosystems® 3500xl 系列基因分析 仪
第二代测序
进入21 世纪，以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的 SOLiD 技术为标志，诞生了第二代DNA 测序技术（next generation sequencing， NGS）
dNTP vs ddNTP
dNTP 5'磷酸基 3'羟基
ddNTP 5'磷酸基
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 dNTP4…………………………dNTPN
DNA链顺利延伸
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 ddNTP
双脱氧核苷酸链终止
基本原理
第一代测序与第二代测序之间的主要差别是测序通量：
前者每个反应 仅测一个DNA 片段 后者每次反应可检测几百万个DNA 片段
第二代测序
Roche 454 焦磷酸测序 ABI SOLiD 连接法测序
ABI ion torrent 半导体测序
Illumina SBS测序
第三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，也被称为下下代测序 (Next-Next-generation sequencing)
如在第一个反应体系中加入ddATP，则ddATP 会随机地 代替dATP 参加反应，从而在第一个反应体系中产生以A 结尾的不同长度的核苷酸链。同理其余三个反应体系分 别产生了以T、G、C 结尾的不同长度的片段。
通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 和 放射自显影检测可读取模板DNA 链互补的序列。
Applied Biosystems® 3500xl 系列基因分析 仪
第二代测序
进入21 世纪，以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的 SOLiD 技术为标志，诞生了第二代DNA 测序技术（next generation sequencing， NGS）
dNTP vs ddNTP
dNTP 5'磷酸基 3'羟基
ddNTP 5'磷酸基
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 dNTP4…………………………dNTPN
DNA链顺利延伸
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 ddNTP
双脱氧核苷酸链终止
基本原理
第一代测序与第二代测序之间的主要差别是测序通量：
前者每个反应 仅测一个DNA 片段 后者每次反应可检测几百万个DNA 片段
第二代测序
Roche 454 焦磷酸测序 ABI SOLiD 连接法测序
ABI ion torrent 半导体测序
Illumina SBS测序
第三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，也被称为下下代测序 (Next-Next-generation sequencing)
如在第一个反应体系中加入ddATP，则ddATP 会随机地 代替dATP 参加反应，从而在第一个反应体系中产生以A 结尾的不同长度的核苷酸链。同理其余三个反应体系分 别产生了以T、G、C 结尾的不同长度的片段。
通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 和 放射自显影检测可读取模板DNA 链互补的序列。
基因测序-ppt课件
Flowcell实物图 8
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell表面微观示意图
每个泳道(LaP5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。
边合成边测序（来源：illumina官网）
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Ion Torrent PGM半导体测序
芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每 个碱基只需数秒
美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
SBS测序
特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序 过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
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第三部分
Oxford Nanopore纳米孔单分子技术
【培训课件-临床基因组学】_第七章 Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学
A
G
T
C
A
A
G
C
G
T
C
C
C
A
T
G
...---Ion Sphere™ Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 9+
A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle
‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’
T ACG T ACG T C T GAGCA T CGA
T
Flows 1-4 Flows 5-8 …9-12
… etc.
C
T CAG T T CGCA GGGT AC
G
Ion
Sphere
-----Primer------
A
G
T
C
A
Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 5-8
A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle
Sequencing: Flows
• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step
• The flow order repeats with pattern:
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Illumina MiSeq
NextSeq 500
Life Ion PGM; Ion proton
Roche 454 Genome Sequencer
• GS FLX • GS Junior System
Ge flow order repeats with pattern:
‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’
T ACG T ACG T C T GAGCA T CGA
T
Flows 1-4 Flows 5-8 …9-12
… etc.
A
C
Ion
Sphere
-----Primer------
• 外显子测序（whole exon sequencing） 指利用序列捕获技术将全基因组外 显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
• Contig 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig （重叠群）。
• Scaffold 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要 构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如 3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些 Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。
• 1990年，被誉为生命“登月计划”的国 际人类基因组计划启动。
• 1999年9月，中国加入这一研究计划， 负责测定人类基因组全部序列的1％。
• 2003年完成，比预计提前2年。
• 六国（美、日、英、法、德、中）科学 家历经了13年花费了27亿美元才完成的 草图。
• 尽管第一代测序技术已经帮 助人们完成了从噬菌体基因 组到人类基因组草图等大量 的测序工作，但由于其存在 成本高、速度慢等方面的不 足，并不是最理想的测序方 法。
A
G
T
C
A
A
G
C
G
T
C
C
C
A
T
G...---Ion Sphere™
Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 1-4
焦磷酸测序
数据分析
polymerase
(DNA)n + dNTP
(DNA)n +1 +PPi
Sulfurylase
ATP
APS+PPi
Lucifetase
ATP + luciferin
oxyluciferin
dNTP Apyrase ATP Apyrase
dNDP + dNMP + phosphate ADP + AMP + phosphate
• Reads 又称读长，高通量测序中一个反应获得的测序序列或测序出来 的一条条序列 。
• 测序深度 是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设 一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。
• 覆盖度 是指测序获得的序列占整个基因组的比例。
高通量测序平台
Roche 454 Genome Sequencer FLX
“下一代”测序技术
Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分 子进行序列测定，效率极高
• 技术特点：每次测很短的片段 （读长较短），但是可以通过 超大量的平行测序，获得大量 的序列。
高通量测序的常用名词
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条 核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术 (next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测 序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)
• 基因组重测序（Genome Re-sequencing） 是对基因组序列已知的个体 进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
• de novo测序 也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对 某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装， 从而获得该物种的基因组图谱。
Clonal Amplification
Isolate Positive Ion Sphere™ Particles
Template Preparatquence
DNA Sequencing*
Data Analysis
Data Analysis
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
To column receiver
Sequencing: Flows
• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a wa序
数据分析
序列是什么呢？ ....
Life Technology Ion平台
Ion PGM™ 系统
Ion Proton™系统
Ion S5™ 系统
Ion Chef™ 系统
Ion torrent PGM的基本原理
DNA / RNA
Prepare Library
Library Preparation
临床基因组学 第七章
Sanger测序及高通量测序技术
• 第一节 核酸测序技术的发展 • 第二节 Sanger测序技术 • 第三节 高通量测序技术及其应用
第三节 高通量测序技术及其应用重点
高通量测序的发展 第二代测序的基本原理及操作流程 第三代测序的基本原理 高通量测序的结果分析及临床应用
• 人类基因组约含4万到10万个基因，由 约30亿个碱基对组成，分布在细胞核的 23对染色体中。