胃蛋白酶分离纯化技术研究进展

胃蛋白酶 ( pep sin) 属于天冬氨酸蛋白水解 酶类 , 是胃消化蛋白水解酶 , 相对分子量为 31 36KD[ 1 ] , 其前体是胃蛋白酶原 , 胃蛋白酶原在成 年脊椎动物胃黏膜中合成 , 由胃主细胞分泌 , 在 胃液的酸性条件下转换成胃蛋白酶 。不同动物来 源的胃 蛋 白 酶 含 量 多 少 主 要 依 动 物 的 食 性 而 改 变 : 草食性动物 >肉食和杂食性动物 , 最低是反 刍类动物 。胃蛋白酶被作为优良的消化药广泛应 用 , 主要剂型有含糖胃蛋白酶 、胃蛋白酶片 、与 胰酶和淀粉酶配伍制成多酶片 。在工业上 , 胃蛋 白酶广泛应用于方便食品 , 如奶酪 、口香糖的加 工 。近年来 , 该酶在啤酒 、果酒等澄清方面也显 示了应用潜力 [ 2 ] 。
离子交换法一直以来都是酶生产所常用的方 法 。它是一项利用溶液中各种带电粒子与离子交 换剂之 间 结 合 力 的 差 异 进 行 物 质 分 离 的 操 作 技 术 。具有简便 、高效 、成本低 , 且可自动化连续 操作的优点 [ 11 ] 。
陈躬瑞 (2001) 等人在纯化蘄蛇胃蛋白酶时 将 SDS沉淀后的上清液上样到预先用 0105mol/L 乙酸缓冲液 ( pH510 ) 平衡的 DEAE - TOYOPE2 ARL 离子交换色谱柱 ( 416mm ×100mm ) 上 , 用 0 0125mo1 /L NaC l梯度洗脱 , 流速为 1mL /m in。 得到的酶在 50℃30m in有较高的活性 , 有望应用 于高温食品加工中 [ 9 ] 。 213 双重层析配合法
中国食品添加剂 试验研究 China Food Additives
胃蛋白酶分离纯化技术研究进展
王莹 , 张丽萍
(黑龙江八一农垦大学食品学院 , 大庆 163319)
摘 要 : 本文阐述了以胃黏膜为原料生产胃蛋白酶的多种先进分离纯化技术和方法 , 分析比较了不同技 术方法的特点 , 根据不同方法和特点 , 提出了进一步的技术研究思考 。
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L - 赖氨酸亲和层析 ( 24cm ×116cm ) 提纯 , 缓 冲液流速为 50mL / h, 收集层析后活性部分 , 然 后用 Sephadex G - 100 凝胶过滤 , 得到羊胃蛋白 酶 pH110 415, 20℃, 24h不失活 , 然而猪胃蛋 白酶 pH715, 20℃下 1m in就失活 , 40℃30 s活性 完全丧失 。此法在分离和纯化后都用到了透析及 冷冻干燥 , 大大缩短了提取时间 。
2 胃蛋白酶的纯化技术
为了满足工业 、制药或科研的需要 , 初分离 的胃蛋白酶 (主要是胃蛋白酶 A、B、C、D 及杂 蛋白和小分子物质 ) 要通过凝胶过滤 、层析进行 纯化 。 211 凝胶过滤
凝胶过滤主要是利用凝胶的多孔性 , 当样品 溶液通过凝胶柱时相对分子质量较大的物质由于 直径大于凝胶网孔 , 而只是沿着凝胶颗粒的孔隙 随着溶剂首先流出层析柱 [ 10 ] 。
关键词 : 胃蛋白酶 ; 激活 ; 纯化 中图分类号 : Q53917 文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 2513 (2008) 01 - 0110 - 04
P rogre ss in sepa ra tion and purifica tion techno logy of pep sin
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围 亲水基团与水形成水化膜的程度 , 以及蛋白质分 子带有电荷的情况决定的 。当用中性盐加入蛋白 质溶液 , 中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质 , 于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失 。 同时 , 中性盐加入蛋白质溶液后 , 由于离子强度 发生改变 , 蛋白质表面电荷被大量中和 , 更加导 致蛋白溶解度降低 , 使蛋白质分子之间聚集而沉 淀 [4]。
×60cm ) 层 析 柱 , 获 得 胃 蛋 白 酶 比 活 为
112
7113μmol/ (m in·m g) [ 7 ] 。 基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较
分析可以看出 , 长期以来分离提取技术一直没有 取得较大的突破 , 用有机溶剂 、盐析等技术得到 的天然胃蛋白酶产品 , 纯度 、生物活性愈将不能 满足医药品和工业日益增长的需要 。随着分离科 学技术的不断发展 , 采用新型分离技术分离胃蛋 白酶已势在必行 。因此 , 笔者认为以下几种技术 是胃蛋白酶分离纯化的方向 。 21311 有机溶剂与盐析共沉淀
为了获得高活力的胃蛋白酶 , 还常将两种层 析方法配合使用 。张继平 ( 2004) 对暗纹东方鲀 胃蛋白酶的纯化时 , 采用 CM - Cellulose 柱纯化 (215cm ×30cm ) , 洗脱液为 0105mol/L pH510 柠 檬酸缓冲液 , 0 110mol/L NaC l直线梯度洗脱 , 流速 为 0125mL /m in, 部 分 收 集 , 每 管 收 集 约 4mL , 合并活力峰 , 再经 Sephadex G - 75 (215cm
0191沉淀胃蛋白酶 。此法生产的粗胃蛋白酶活 力为 10000倍 , 得率为 218% 310%。
我国生产胃蛋白酶的主要工艺是应用有机溶 剂沉淀法 , 得到的是混合的胃酶 。此法的特点是 有机溶剂的分辨力相对较高 , 溶剂易于除去回 收 , 但反复萃取会增加溶剂消耗 , 也会造成酶部 分失活 , 影响得率 。 112 盐析法
随着亲和层析技术的应用 , Nevaldine和 Kas2 sell (1971) 应用亲和层析 (聚 - L - 赖氨酸共价 连接 Sepharose 4B ) 方 法 纯 化 了 羊 胃 蛋 白 酶 [ 8 ] 。 此法将粗提所得固体用醋酸钠缓冲液溶解 , 聚 -
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源自文库
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
美国专利 ( 2, 701, 228 ) 改进后 , 用锌盐 沉淀胃酶 。当母液含醇 (或酮 ) 在 50% 55%、 pH在 510 512时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉 淀 , 沉淀物为胃酶的锌盐 , 然后用金属鳌合剂除 去锌盐 , 得 15000 16000 倍活力的胃酶 , 收得 率为 510% 515%。此法较上述有机溶剂沉淀所 得的胃酶活力和得率都高 。
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1955年美国专利 ( 2, 701, 228 ) 记载了有 机溶剂法提取胃酶和胃酶素的联产工艺方法 。其 方法的核心主要是将胃黏膜用酸性溶液浸提后加 入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0194 0196 先沉淀 胃膜素 , 继续加入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0189
盐析法最大程度地保留了胃蛋白酶的活性 , 如再加入有机溶剂配合使用 , 较单独使用盐析得 到的胃蛋白酶的活力要高 , 回收率大 。但实际生 产中此方法还未见报道 。盐析过程带来的盐离子 越多 , 会给后续工艺除盐带来障碍 , 所以在盐析
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赵永芳 (1993) 等人将用 pH713的磷酸盐缓 冲溶液浸提的猪胃黏膜匀浆 、过滤后 , 将滤液用 10% 80%的硫酸氨分级盐析 , 低温离心收集沉 淀 , 溶解后激活为胃蛋白酶 [ 5、6 ] 。张继平 ( 2004) 在分离暗纹东方纯胃蛋白酶时 , 预先用 5mL 匀浆 液体测定硫酸铵盐析曲线 , 而且采用在匀浆液中 加入 1%的无水乙醇 , 然后选择 20% 40%硫酸 铵进行沉淀 , 经透析 、离心后获得粗酶制剂 [ 7 ] 。
有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提 取浓 缩 , 通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮 。此种方 法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解 度的差异而实现分离的 [ 3 ] 。
收稿日期 : 2007 - 10 - 10 作者简介 : 王莹 (1981 - ) , 女 , 在读硕士 , 研究方向 : 畜产品加工 。
1 胃蛋白酶的分离技术
目前国内对胃蛋白酶的分离技术主要是应用 有机溶剂提取法 、盐析法 、或底物亲和法进行粗 分离后 , 得到混合的胃酶 (包括胃蛋白酶 A、B、 C、D ) , 但应用到生产中的只有有机溶剂提取法 和盐析法 。国外则对此研究较早 , 主要集中在 20 世纪六七十年代 , 经盐析得到了商业结晶胃蛋白 酶。 111 有机溶剂沉淀法
赵永芳 ( 1993) 利用聚 - L - 赖氨酸 - 琼脂 糖亲和色 谱介质 分离 猪 胃 蛋 白 酶 , 得 酶 活 为 16480U。首 先 用 pH512 的 0115mol/LNaC l 0 0101mol/L 醋酸盐缓冲液将激活的胃蛋白酶溶液 透析 , 测定酶活性及蛋白量 。将合成的亲和色谱 介质 装 柱 ( 115 ×1415cm ) , 依 次 用 011mol/L NaHCO3 、015mol/L NaCl溶液洗涤 , 再用 pH512 的 0115mol/L NaC l 0 0101mol/L 醋酸盐缓冲液 平衡柱 , 待基线平稳后 , 开始上样 , 控制流速为 20mL / h。上样完毕后 , 采用梯度洗脱 , 洗脱液用 pH512的 0101mol/L 醋酸盐缓冲液 , 线性梯度为 0115 1mol/L NaCl, 流速 20mL / h, 于 280nm 检 测蛋白峰 , 通过测活判断酶峰 [ 6 ] 。 212 离子交换层析
美国在 20世纪 60年代研究结晶为蛋白酶的 生产工艺时 , 是将 75mg的胃蛋白酶原样本溶解 在 8mL 的蒸馏水中 ( pH510 610 ) , 在 14℃ ± 1℃, pH210下 , 保持 20m in激活 (胃蛋白酶原在 此 pH时自动转化为胃蛋白酶的过程 ) 。然后用磺 乙基 Sephadex G - 25柱层析 , 最后用羟基磷灰石 进行色谱层析 。结果表明用层析法得到的胃蛋白 酶为单一物质纯品 [ 5 ] 。
W ANG Y ing, ZHANG L i2p ing
(College of Food Science, Hei Long J iang August First Land Reclam ation University, Daqing 163319)
Abstract: Reviewed the separation and purification of pep sin from gastric mucosa. And the possible technology are mentioned according to the method and the characteristic which is compared in the essay. Key words: pep sin; activity; purified
过程中加入一定量的有机溶剂 , 减少硫酸铵的用 量 , 将是今后工艺改进的重点 。
胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法 , 其主要目的是将酶液进行浓缩 、除盐及小分子物 质 。此法常配合盐析使用 , 以缩短提取时间 [ 5 ] 。 113 底物亲和法
底物亲合法是利用酶 (胃蛋白酶 ) 与其底物 (酪蛋白 ) 的亲和性 , 从胃黏膜中提取得到胃蛋 白酶 。使底物和酶在 pH215的乳酸缓冲液中充分 结合 , 然后调 pH 至 410 (底物的等电点 ) 沉淀 底物和酶的结合物 , 随后让沉淀物再溶解于乳酸 缓冲液中 , 添加低浓度的 SDS将底物和酶分离 , 得到酶 - SDS复合物 , 再进一步分离纯化 。陈躬 端 (2001) 成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了 实验室分离 , 得率大约为 30%。与传统的分离方 法比较 , 此法具有简单高效的优点 , 为后续的纯 化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用 , 同 时具有较高的特异性 [ 9 ] 。