质粒构建步骤设计
质粒构建实验步骤1
质粒构建实验步骤实验一1．将合成的引物溶解（10uM），分别扩增P1P2，P3P4，2．PCR扩增条件如下：95 ℃ 10 min95 ℃ 30 s50℃ 30 s 10cycle72℃ 30 s72℃ 5min3.反应体系为：20 ul （p1p2和p3p4各两管）dNTP 2 ul10xBuffer 2ulTaq 0.4 ulPrimer P1 （P3） 1.0 ulPrimer P2 （P4） 1.0 ulH2O 13.6 ul4．将产物电泳，检测是否为目标片断（分别为A1B、A2B）,证实为目的片断以后，进行后续扩增5．将扩增出的AB和CD片断等摩尔加入作为模板进行第二次PCR，并且在第二次PCR 时加入引物扩增25个循环，PCR扩增条件如下：95 ℃ 15 min95 ℃ 30 s60 ℃ 30 s 25cycle72℃ 40 s72℃ 5min6．反应体系为：100uldNTP 10 ul10xBuffer 10 ulTaq 1ulProduct P1P2 2 ulProduct P3P4 2 ulPrimer F 1 ulPrimer R 1 ulH2O 73ul实验二连接载体DNA外源DNA片段10×T4 DNA ligase bufferT4 DNA ligase 0.5μl16℃保温8-24小时。
做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。
实验三10．转化①取100ul感受态细胞置于冰上融化，将50ul感受态细胞加入至10ul连接产物中，冰上30min。
②42℃放置45~60s，冰上放置2~3min。
③加入37℃预温好的200ul LB液体培养基（不含Amp）④37℃振荡培养1h（160~220 rpm）11．铺板铺板之前要先将AMP抗性的LB固体培养基先预温到常温，然后取100 ul菌液涂板，37℃培养过夜（16~24h）12．不带有质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。
质粒构建 (2)
质粒构建1. 引言质粒是一种重要的实验工具，广泛应用于基因工程、遗传学和生物学研究中。
质粒构建是指将感兴趣的DNA片段插入到质粒中的过程，用于进一步研究DNA序列的功能和相互作用。
本文将介绍质粒构建的基本原理和步骤。
2. 质粒构建的基本原理质粒构建需要以下几个基本要素：•质粒：质粒是一种环状的DNA分子，可存在于细菌、酵母等生物体内。
•DNA片段：DNA片段是质粒构建中要插入质粒的感兴趣DNA序列，可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
•限制酶：限制酶是一种特殊的酶，能够识别和切割DNA的特定序列。
•连接酶：连接酶是一种酶，能够将DNA片段与质粒连接起来。
基于以上要素，质粒构建的基本原理如下：1.将质粒和目标DNA片段分别进行限制性内切酶切割。
限制酶切割会产生粘性末端或平滑末端的DNA片段。
2.使用连接酶将目标DNA片段与质粒连接起来。
连接酶能够将两条DNA片段的末端连接起来，形成一个完整的质粒。
3.利用转化或转染等方法将质粒导入到宿主细胞中。
质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
3. 质粒构建的步骤质粒构建的具体步骤如下：3.1 质粒提取从质粒宿主细胞中提取质粒是质粒构建的第一步。
常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法、商业提取试剂盒等。
质粒提取的目的是获取纯度较高的质粒样本，便于后续实验操作。
3.2 目标DNA片段的获取目标DNA片段可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
PCR扩增需要设计引物，引物的序列与目标DNA片段的两端相互衔接。
基因合成则需要将目标DNA序列依照设定的序列进行化学合成。
3.3 DNA片段与质粒的连接将目标DNA片段与质粒进行连接，需要使用连接酶。
连接酶则需要根据DNA片段和质粒的不同情况选择合适的连接酶和反应条件。
连接酶反应通常包括连接酶、DNA片段和质粒的混合体系，以及一定的温度和时间。
3.4 转化或转染将连接好的质粒导入到宿主细胞中，以使质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
质粒构建流程范文
质粒构建流程范文质粒是在分子生物学研究中常用的载体，用于将外源基因导入到真核或原核细胞中。
质粒构建是将所需基因插入质粒中的过程，通常包括以下几个步骤：选择适当的质粒骨架、获得目标基因、PCR扩增目标基因、消除酶切位点、连接、转化宿主细胞和筛选等。
下面将详细介绍质粒构建的流程。
第一步：选择适当的质粒骨架质粒骨架是质粒的基本结构，包括起始子、终止子、选择性标志物和多个酶切位点，用于插入目标基因。
在选择质粒骨架时，需要考虑质粒复制起源、复制调节元件和基因表达调节元件等因素。
第二步：获得目标基因目标基因是要插入到质粒中的外源基因，可以是从生物体中提取的DNA或通过合成DNA获得的。
在获得目标基因时，需要考虑基因的大小、序列特征和功能等因素。
第三步：PCR扩增目标基因PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可以通过引物在DNA模板上进行反复扩增，得到大量的目标基因的DNA片段。
在PCR扩增目标基因时，需要选择适当的引物和反应条件，并进行反应优化和扩增验证。
第四步：消除酶切位点在插入目标基因之前，需要消除质粒骨架内的酶切位点，避免再次被酶切产生的片段。
可以通过点突变、限制性内切酶切除和引物设计等方法消除酶切位点。
第五步：连接将PCR扩增的目标基因与质粒骨架连接，通常可以通过限制性内切酶切除和连接、引物设计和T4DNA连接酶等方法实现。
在连接时，需要考虑连接位点的互补性和酶切位点的匹配等因素。
第六步：转化宿主细胞质粒构建完成后，需要将其转化到适当的宿主细胞中，使其在细胞内复制和表达。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。
第七步：筛选转化后的宿主细胞需要进行筛选，以获得携带目标基因的阳性克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR鉴定等。
质粒构建是一项复杂而精细的实验技术，需要熟练的实验操作和严密的实验设计。
在实验过程中，需要注意反应体系的优化、质粒构建产物的验证和质粒的稳定性等因素。
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建质粒构建是酵母菌表面展示技术的关键步骤之一。
通过质粒构建，可以将目标蛋白基因与表面展示载体进行连接，实现对目标蛋白在酵母菌表面的展示。
以下是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的具体内容。
第一步：目标蛋白基因与表面展示载体设计根据目标蛋白的特性和所需实验目的，选择合适的表面展示载体。
常用的载体有pCTCON2、pYD1、pYD2等。
此外，还需要根据质粒构建所需的连接酶切位点，设计引物对目标蛋白基因进行扩增。
第二步：目标蛋白基因扩增利用PCR方法，使用设计好的引物对目标蛋白基因进行扩增。
扩增条件可以根据目标片段的长度和GC含量进行优化。
扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小，并使用纯化试剂盒纯化产物。
第三步：表面展示载体线性化将表面展示载体进行限制性酶切，选择合适的限制性酶对载体进行切割。
切割产生的末端可以根据所需进行处理。
线性化的表面展示载体可以提高质粒的转化效率和稳定性。
第四步：目标蛋白基因与表面展示载体连接将线性化的表面展示载体与目标蛋白基因进行连接。
连接可以通过多种方法进行，如PCR法、接头连接法等。
连接方法的选择应根据实验需求进行。
第五步：连接产物转入宿主酵母菌将连接好的质粒转化到酵母菌宿主细胞中。
转化可以选择化学法或电转法进行。
转化后，将细胞均匀涂布在含有适当选择性的培养基上，利用培养基中的选择性条件筛选转化成功的菌落。
第六步：筛选和鉴定质粒对于转化成功的菌落，进行筛选和鉴定。
首先通过酵母菌表面展示的方法对菌落进行初步筛选。
初步筛选后的菌落进行PCR扩增，使用测序方法对扩增产物的序列进行验证。
第七步：质粒抽提和进一步分析对于验证成功的酵母菌菌株，进行质粒抽提。
常用的质粒抽提方法有碱裂解法、按序列分析法等。
抽提得到的质粒可以进行进一步分析，如限制性酶切、测序等。
以上就是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的内容。
通过以上步骤，我们可以构建目标蛋白的表面展示载体，并将其成功转化到酵母菌中，为后续的酵母菌表面展示实验打下基础。
质粒构建全过程范文
质粒构建全过程范文质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术，用于将目标基因插入到质粒中，进而导入到宿主细胞中。
下面将详细介绍质粒构建的全过程。
第一步：设计引物在质粒构建之前，需要设计引物，包括引物序列的选择和设计。
引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。
引物的选择应考虑到目标基因的特点，如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。
第二步：PCR扩增目标基因通过PCR反应扩增目标基因，此过程中，使用上一步设计的引物。
PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点，如长度和GC含量。
扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第三步：准备载体质粒选择一个合适的载体质粒，根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。
将质粒提取并进行消毒处理，以去除可能的污染物。
第四步：限制性内切酶切质粒与目标基因通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因，以生成互补的黏性末端。
第五步：连接目标基因与载体质粒将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。
此时，两者的黏性末端会互相连接，形成短暂的连接体。
可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。
连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第六步：转化宿主细胞将连接后的质粒转化到宿主细胞中，以使宿主细胞具有新质粒。
转化的方法有多种，包括化学法、电渗透法、热冲击法等。
选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。
第七步：宿主细胞筛选与鉴定转化完成后，宿主细胞需要进行筛选与鉴定。
一般来说，可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。
通过培养在含有抗生素的培养基上，只有含有质粒的细胞能够生长。
第八步：验证目标基因的插入通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中，并且在宿主细胞中表达。
可以使用特异性引物扩增目标基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
测序可以进一步验证目标基因的正确性。
第九步：扩增检测阳性菌落通过原核培养使阳性菌落扩增，以获得足够大量的质粒实验使用。
质粒构建步骤
质粒构建步骤
嘿，你问质粒构建步骤啊？这事儿还挺复杂，不过咱慢慢说。
第一步呢，得先确定你要构建啥样的质粒。
就像你要盖房子，得先有个设计图吧。
想好你要把哪些基因放进去，要让质粒有啥功能。
这可不能瞎整，得有个明确的目标。
第二步，准备材料。
你得有合适的载体质粒，就像盖房子得有块地一样。
还有你要插进去的基因片段，这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。
还得有各种酶啊，像剪刀一样把东西剪开再拼起来。
第三步，把基因片段剪下来。
用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。
这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。
得小心点，可别剪坏了。
第四步，把基因片段插进载体质粒里。
这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。
用另一种酶把载体质粒打开一个口子，然后把基因片段塞进去。
再把口子封上，让它们连在一起。
第五步，验证一下你构建的质粒对不对。
可以用一些方法，比如测序啊，看看基因片段是不是插对地方了，有没有弄错啥的。
要是不对，就得重新来过。
比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。
他先想好要把哪个发光基因插进去，找好了载体质粒和各种酶。
然后小心翼翼地把发光基因剪下来，插进载体质粒里。
最后验证的时候发现插对了，可高兴了。
把这个质粒放到细菌里，细菌就真的发光了。
所以说啊，质粒构建可不是件容易的事，得一步一步来，细心又耐心。
咋样，现在知道质粒构建的步骤了吧？。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
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ALS相关基因蛋白表达载体的构建
材料:含有GST载体pGEX-6p-1的菌（约5kb）；SMN1d（大约1kb）和C9ORF72(大约1.5kb)基因；BamH1和EcoR1酶Cutsmart。
步骤：
一、目的基因的获得
1、引物设计
2、将含有目的基因的质粒进行PCR.( μl)
3、DNA电泳（1g琼脂糖/100m1XlTAE）以检测PCR产物。
0 1 2 3 4 5 6 7 8
4、跑胶并回收
5号和6号（SMN）共40μl全部加到一号孔中
7号和8号(C9ORF72)共40μl全部加到三号孔中
五号孔加5μlMarker
回收：
1、在紫外光下将目的带切下，放入两个EP管中
2、每管中加250μl Binding Buffer, 60℃,7分钟融化
3、将溶化后的胶加入到柱子中；10000xg 1min离心,弃液
4、加300μlBinding Buffer,10000xg 1min离心，弃液
5、加700μlSPW洗两次，10000xg 1min离心，弃液
6、12000xg，2min离心，挥干乙醇
7、超净台内吹2min
8、加30μlddH2O静置1min，10000xg 1min离心
9、重溶解一遍
二、质粒的获得：
1、扩大培养：将菌种接种(20μl)到含有AMP（5μl）的培养基(5ml)上，
37℃摇过夜。
2、提质粒：
1、收集50-100ml过夜培养的菌液10000rpm离心1分钟，尽量
吸除上清
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液Ⅰ，使用移液器
或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
3、向离心管中加入250μl溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌
体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过2分钟，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入350μl溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，
充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
5、20000rpm离心10分钟。
6、将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），
室温放置2-3分钟，10000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μlHB清洗，10000rpm离心1分钟，倒
掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱重加入700μlWB，10000rpm离心1分钟，弃掉收
集管中的废液。
9、重复8
10、将吸附柱放回收集管中，15000rpm离心2分钟，将吸附柱
置于室温放置3-5分钟，挥发乙醇。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬
空滴加30洗脱液缓冲液或去离子水，室温放置2分钟，10000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
12、测浓度或跑胶验证并在-20℃保存。
（将1μl的loading与
1μl的质粒混合点样）
三、载体构建
1、双酶切目的基因和质粒(单位μl)
每个体系37.6μl，37℃水浴4h。
2、连接
2μl载体+6μl目的片段+1μlT4 Buffer+0.5μlT4酶+0.5μl水共10μl室温1h
四、转化与筛选：将构建好的质粒转入感受态宿主细胞中并接种于含有
Amp的培养基中，筛选导入质粒的细胞。
1、取感受态大肠杆菌在冰上融化
2、将酶连产物全部加入感受态中，混匀，在冰上放置30min
3、42℃热激90s，马上放在冰上，放置3min
4、加750μl无抗LB，37℃摇床摇45min
5、5000xg离心4min，弃650μl上清重悬
6、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，37℃培养
箱过夜
SMN C9ORF72 空白质粒
(AMP持续效率只有十七个小时左右，所以不能培养时间过长)
五、目的基因检测
1、挑取单菌落接种于含AMP的LB中，37℃摇床扩大培养，过夜
2、做PCR或酚氯仿快检
重组质粒快检的具体方法
快检就是直接用摇起的菌液取 100uL，加 50uL 的苯酚和50uL 的氯仿涡旋离心，取上清跑胶，对照上个空载体，
3、跑胶并确定目的菌(点样2μl)
M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M SMN-PCR
M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 0 C9ORF72-快检
M 0 1 6 1 6 0 M C9ORF72-PCR
SMN: 2号 C9ORF72：1号和6号
4、测序，保菌，提质粒。
感受态的制备：
1.接菌到加有5 ml LB培养基的15 ml离心管中扩大培养，37℃摇床过夜。
2.将过夜所得到的菌液接种到含250 ml LB的1 L锥形瓶中, 37℃培养至OD值为0.4~0.6。
3.用50 ml离心管分装，4℃，4500 g离心10 min，弃上清（此步往下在冰上操作）。
4.用30ml 0.1mol/L的氯化钙轻柔重悬。
5.4℃，4500 g离心10 min。
6.弃上清，加2ml氯化钙重悬，加甘油（甘油最终浓度为20%）。
7.分装1.5 ml EP管中，每个50 μL，-80℃储藏。
转染
1. 转染前一天，在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到70 - 90 ％。
2. 准备复合物：
100µl不包含血清的Opti-MEM培养基+1µg质粒; 100µl不包含血清的Opti-MEM 培养基+5µl Lipofectamine，孵育五分钟；轻轻混匀后在室温下再孵育15分钟。
3. 将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。
通过轻轻地前后摇动培养板混合。
4. 37 ℃，CO2培养箱孵育,在转染后4-6小时改换培养基。
IF
1.细胞用预冷的PBS洗3次，
2.用预冷的4％多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次；
3.再用0．1％的Tritonl00穿透细胞10 min，PBS洗3次；
4.加蛋白抗体，37℃孵育1 h或4℃过夜，PBS洗3次；
5.加荧光素标记的二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次；。