凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤

实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量

实验仪器和试剂：电子天平 酸度计 离心机 移液器 45度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl ） 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器

实验步骤：

1、称取1.21g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.2mol/L 。

2、用移液器取429ul 盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.1ml/L 。

3、从1去25ml ，从2取40ml 混合调PH 到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ml 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。

6、取3（Tris 缓冲液）1.6ml ，稀释纤维蛋白原0.008g ，浓度0.5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

8、从5取上清液100ul 。

9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。

11、计算公式为：2

211V C V C U

其中

C1=凝血酶的浓度

C2=样品的浓度

V1=滴加凝血酶的体积

V2=取样的体积

注：

1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样100ul检测，检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul检测，检测步骤和计算方法不变。